Методы для быстрой передачи и локализации патогенов Болезнь Лайма В Tick Gut
14 февраля 2011 г.
Лайма исследования медицинских исследований часто требуют поколения клещей инфицированы возбудителем Borrelia burgdorferi, процесс, который обычно занимает несколько недель. Здесь мы показываем, микроинъекции основе тик инфекции процедура, которая может быть выполнена в течение нескольких часов. Мы также продемонстрировать метод иммунофлюоресценции на месте локализации B. burgdorferi в клещи.
Общая цель данной процедуры заключается в микроинъекции и локализации клеток borrelia berg de ferry в кишечнике клеща. Это достигается путем предварительного изготовления стеклянных капиллярных игл и их заполнения клетками beberg de ferry. Затем клетки beberg defer вводятся в кишечник клеща с помощью микроинъекции.
Затем клеща препарируют и извлекают ткани кишечника. В завершение проводят иммунофлуоресцентное мечение beberg defer в кишечнике клеща. В конечном итоге с помощью конфокальной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие локализацию beberg to ferry в кишечнике клеща.
Здравствуйте, я доктор Рут Пол, доцент кафедры ветеринарной медицины Университета Мэриленда. Сегодня двое сотрудников моей лаборатории — Торо Каиро, postdoctoral fellow, и Адам Коулман, аспирант, продемонстрируют вам процедуру искусственного заражения клещей методом микроинъекций, которую мы регулярно проводим в нашей лаборатории. После микроинъекции мы препарируем клеща и визуализируем бактерии в кишечнике клеща с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
Основным преимуществом микроинъекций в клещей по сравнению с получением поколения естественно инфицированных клещей является продолжительность процедуры. Микроинъекции сокращают общее время проведения процедуры с недель до часов, так как для получения инфицированных клещей путем естественного питания требуется примерно пять недель. Этот метод также может быть адаптирован для введения других полезных реагентов, таких как двухцепочечная РНК для РНКи или антисыворотки для специфического антительного вмешательства внутри клеща.
Для начала изготовьте несколько игл для микроинъекций, нагревая и вытягивая стеклянные капиллярные трубки диаметром один миллиметр с помощью вытягивателя микропипеток. Осторожно извлеките хрупкие капиллярные трубки. Храните собранные иглы концами вверх на адгезивной ленте в чашке Петри.
Затем культивируйте b berg de ferry в среде BSK. Доведя концентрацию до примерно 10⁷ клеток на мл, осадите b berg de ferry путем центрифугирования при 3000 ×g в течение 10 минут. При комнатной температуре удалите супернатант и полностью ресуспендируйте осадок в среде BSK, осторожно пропуская его через стерильный микропипеточный наконечник объемом 200 µL до конечной концентрации 10⁹ клеток на мл.
Поскольку клетки ресуспендируют при высокой плотности и они могут слипаться, клеточную суспензию следует использовать для микроинъекций немедленно. Для подготовки клещей наклейте прозрачную двустороннюю клейкую ленту на предметное стекло, используя липкий коврик; осторожно извлеките клещей из контейнера. С помощью маленькой кисточки поместите необходимое количество клещей для инъекции на клейкую ленту брюшной стороной вверх, ориентируя их в одном направлении. Загрузите 5 µL культуры Beberberg de Ferry в капиллярную иглу. Используя наконечник микропипетки объемом 20 µL, проверьте иглу на наличие пузырьков воздуха и при необходимости повторно заполните иглу бактериальной культурой.
При необходимости рассмотрите клеща под бинокулярным диссекционным микроскопом и сфокусируйтесь на области анального отверстия клеща. Осторожно коснитесь кончика капиллярной иглы, чтобы переломить трубку в месте, где ее диаметр немного меньше диаметра анального отверстия клеща, формируя иглу для микроинъекций. Этот этап является критически важным, так как любые попытки провести инъекцию клеща с использованием неподходящих кончиков игл приводят к травмам и возможной гибели насекомого.
Перейдите к инъекционному клещу. Поместите иммобилизованных клещей под диссекционный бинокулярный микроскоп и сфокусируйтесь на анальном отверстии, которое прикрыто двумя подвижными анальными пластинками. С помощью тонкого пинцета осторожно коснитесь любой области рядом с анальным отверстием, оказывая очень легкое давление.
Это позволит разделить анальные пластинки и открыть анальную пору, которая соединяется с кишечником. Осторожно введите кончик иглы немного в анальное отверстие через принудительно созданный разрыв в анальных пластинках. Глубину введения иглы следует свести к минимуму, так как стеклянный кончик может повредить полупрозрачную заднюю кишку, соединяющуюся с прямой кишкой.
С помощью микроинъектора, оснащенного автоматическим ножным управлением, введите раствор beberg de ferry, используя следующие параметры: давление впрыска 1000 Hector Pascals, время впрыска 0,2 seconds и компенсационное давление 8 Hector Pascal's. Каждому зародышу делают одну инъекцию после микроинъекции.
Клещ должен проявлять признаки движения или ползать в ответ на стимулы, как и до инъекции. Для препарирования клещей с целью иммунофлуоресцентной микроскопии сначала нанесите каплю фосфатно-солевого буферного раствора на чистый предметное стекло для препарирования и еще одну каплю на стекло, покрытое поли-L-лизином. Для микроскопии подготовьте еще одно предметное стекло с двусторонним адгезивным скотчем. Затем извлеките клеща из контейнера и поместите его на двусторонний адгезивный скотч.
Используя маленькую кисточку под диссекционным микроскопом, сфокусируйтесь на клеще. Поместите острое лезвие бритвы на клеща между первой и второй парами ног. Плотно нажмите, разрезая клеща на две части, чтобы обнажить брюшко; немедленно погрузите брюшко в каплю PBS с помощью тонкого пинцета. Захватите дорсальный и вентральный экзоскелеты вокруг места разреза.
Осторожно потяните спинной щиток вверх и в сторону от клеща, открывая коричневатые дивертикулы кишечника. Следите за тем, чтобы препарируемые клещи постоянно находились в PBS. Полупрозрачные пучки слюнных желез расположены по обе стороны от переднего отдела кишечника; при необходимости их можно удалить на данном этапе.
Удерживая оставшуюся часть экзоскелета пинцетом, осторожно извлеките кишечник из брюшка. Тщательно очистите кишечник, удалив любые прилипшие ткани, например, трахеи. С помощью кончика тонкого пинцета быстро перенесите кишечник клеща в каплю PBS на предметное стекло с поли-L-лизином.
Разделите кишечник на более мелкие фрагменты с помощью тонких лезвий или осторожно надавливая кончиком тонкого пинцета. Тщательно аспирируйте избыток PBS вокруг тканей кишечника. Оставьте ткани кишечника высыхать на воздухе при комнатной температуре.
Зафиксируйте кишечник клеща, погрузив его в ацетон на 10 минут. Дайте ему высохнуть на воздухе при комнатной температуре; на данном этапе предметные стекла можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре -20 °C в герметичном контейнере. Для иммунофлуоресцентного мечения кишечника обведите зафиксированный кишечник клеща пап-ручкой или другим средством для создания гидрофобного барьера.
Это поможет удержать окрашивающие растворы во время последующих этапов инкубации. Покройте кишечник клеща одной или несколькими каплями блокирующего буфера на 30 минут. При комнатной температуре.
Сыворотка, используемая для блокировки, подбирается в зависимости от вида животного, в котором были получены антитела. С этого момента не допускайте высыхания предметного стекла. Медленно аспирируйте блокирующий буфер.
Инкубируйте кишечник с соответствующими растворами первичных и/или вторичных антител. Мы используем антитела к B. berg, меченные флуоресцеином-изотиоцианатом (FITC). Добавьте антитела в разведении 1:100 в блокирующем буфере на один час.
При комнатной температуре накройте контейнер алюминиевой фольгой, чтобы ограничить воздействие света. Удалите раствор антител путем осторожной аспирации. Инкубируйте кишечник с флуоресцентным красителем для маркировки тканей клеща, таким как DPI или пропидиййодид.
Обычно мы используем йодид пробидия в концентрации 20 µg/mL в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, после чего трижды промываем образцы 0,05% раствором Tween 20 в PBS в течение пяти минут. В завершение препарат заключают в буферизированный глицерин, содержащий реагент Antifade, и осторожно накрывают предметным стеклом. На этом этапе препараты можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C в герметичном контейнере, после чего проводят визуализацию и локализацию b berg de ferry с помощью конфокального микроскопа.
Здесь показана микроинъекция клещу с использованием иглы, заполненной красителем кумаси бриллиантовый синий для обеспечения видимости. С помощью тонкого пинцета прилагается легкое давление к телу, что позволяет раздвинуть анальные пластинки и открыть анальное отверстие для микроинъекции. Здесь показана передняя область дивертикула кишечника с красителем беберг-ферри внутри кишечника.
Ядра кишечника и спирохеты окрашивают пропидиййодидом или конъюгированным антителом к beberg ferry соответственно. После освоения методики мы установили, что в 10 клещей можно ввести путем микроинъекций около ста тысяч жизнеспособных особей, инфицированных fer. Хотя клещей можно использовать для других экспериментов сразу, обычно мы ждем один или два дня, чтобы убедиться в их выживаемости после процедуры, прежде чем продолжить.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать искусственно инфицированных клещей с помощью микроинъекций и локального барьерного воздействия в кишечнике клеща с использованием конфокальной иммунофлуоресценции. Работа с клещами и тонкими стеклянными иглами, заполненными человеческим патогеном, таким как Borrelia burgdorferi, может быть опасной во время выполнения процедур. Постоянно контролируйте местоположение клещей и игл и строго соблюдайте меры предосторожности второго уровня биологической безопасности (BSL-2).
Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен метод инфицирования клещей Borrelia burgdorferi с помощью микроинъекций, который позволяет значительно сократить время, необходимое для заражения клещей. Кроме того, продемонстрирован метод иммунофлуоресценции для локализации патогена в тканях клеща.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Биология переносчиков
- Локализация патогенов
Теоретические основы
- Болезнь Лайма вызывается бактерией Borrelia burgdorferi.
- Основными переносчиками этого патогена являются клещи.
- Традиционные методы заражения клещей требуют много времени.
- Методы быстрого заражения позволяют повысить эффективность исследований.
Цель исследования
- Разработать более быстрый метод заражения клещей B. burgdorferi.
- Обеспечить возможность локализации патогена in situ в тканях клеща.
- Углубить понимание взаимодействий между клещом и патогеном.
Используемые методы
- Приготовление стеклянных капиллярных игл для микроинъекций.
- Микроинъекция клеток B. burgdorferi в кишечник клеща.
- Диссекция клещей для выделения тканей кишечника.
- Иммунофлуоресцентное мечение B. burgdorferi в тканях кишечника.
Основные результаты
- Успешная микроинъекция B. burgdorferi в кишечник клеща.
- Эффективная локализация патогена, продемонстрированная с помощью иммунофлуоресценции.
- Результаты, визуализированные с использованием конфокальной микроскопии.
- Метод значительно сокращает время инфицирования клещей.
Выводы
- Метод микроинъекций является жизнеспособной альтернативой для инфицирования клещей.
- Иммунофлуоресценция позволяет точно локализовать патогены.
- Данный подход может способствовать дальнейшим исследованиям передачи болезни Лайма.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Быстрое и контролируемое заражение клещей-переносчиков бактериями Borrelia burgdorferi позволяет эффективно изучать взаимодействия между патогеном и переносчиком, что имеет решающее значение для исследования болезни Лайма. Данный метод микроинъекций сокращает сроки заражения с недель до часов, что способствует высокопроизводительному скринингу и снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах открытий. Этот метод обеспечивает воспроизводимую доставку патогена, повышая прогностическую достоверность при валидации мишеней и разработке рабочих процессов анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия Borrelia burgdorferi с кишечником клеща для проверки терапевтических мишеней, участвующих в персистенции и передаче патогена.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную нагрузку патогеном в когортах клещей, что снижает вариабельность в моделях инфекции и повышает воспроизводимость анализа.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при исследовании функциональных мишеней, позволяя проводить контролируемое воздействие штаммов патогена, включая те, которые аттенуированы в мышиных моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать ткани инфицированных клещей, пригодные для последующего проведения иммунофлуоресцентного анализа и конфокальной микроскопии с целью количественного определения локализации и нагрузки патогена.
- Практическая ценность: обеспечивает получение количественных результатов, готовых для микроскопического анализа, что позволяет стандартизировать показатели обнаружения патогенов в ходе скрининговых кампаний.
- Масштабируемость: облегчает подготовку большого количества однообразно инфицированных клещей, что поддерживает воспроизводимость анализа и повторное использование платформы в системах скрининга на основе переносчиков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает релевантную для заболевания систему изучения локализации Borrelia burgdorferi в кишечнике клеща, связывая результаты исследований in vitro с патофизиологией переносчика.
- Снижение механистических рисков: позволяет визуализировать распределение патогена в тканях клеща, что служит основой для гипотез о тканеспецифичных факторах вирулентности и механизмах передачи.
- Оптимизация доклинической модели: поддерживает принятие обоснованных решений о продвижении исследований путем обеспечения стабильного воздействия патогена для оценки эффективности вмешательств в моделях трансмиссивных заболеваний, переносимых клещами.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в процесс разработки — от валидации мишени до доклинической оценки — за счет обеспечения возможности быстрого получения зараженных клещей-векторов и стандартизированного считывания данных о локализации патогена.
- Открытийная биология: Обеспечивает проверку гипотез о взаимодействиях между патогеном и переносчиком путем доставки контролируемого количества Borrelia burgdorferi в кишечник клеща для изучения механизмов взаимодействия.
- Скрининг: Позволяет получать стандартизированные ткани инфицированных клещей, подходящие для количественного иммунофлуоресцентного анализа, что повышает воспроизводимость рабочих процессов по обнаружению патогенов.
- Аналитика: Обеспечивает получение данных о локализации и нагрузке патогена с помощью конфокальной микроскопии, что позволяет проводить сравнительный анализ различных экспериментальных условий и воздействий.
- Трансляционные исследования: Связывает культивирование патогена in vitro с его локализацией в тканях клеща, что способствует согласованию биомаркеров и подтверждению патофизиологической значимости моделей трансмиссивных заболеваний.
- Применение в различных целях: Создает многофункциональную платформу для инфицирования клещей различными биологическими агентами, включая антитела и реагенты для РНК-интерференции, что расширяет возможности применения метода за пределы исследований Borrelia burgdorferi.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности во взаимодействиях «патоген — вектор» благодаря локализованному обнаружению патогена.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость моделей инфицирования клещей, сокращая временные и ресурсные затраты по сравнению с методами естественного питания.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на ранних этапах поиска за счет предоставления быстрых стандартизированных моделей воздействия патогена для снижения рисков, связанных с выбором мишеней.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять приоритезацию инициатив по исследованию болезни Лайма с учетом рисков благодаря надежным, высокоточным моделям инфицирования, снижающим биологическую вариабельность.
Особенности реализации
- Требуются навыки микроинъекций, работы с клещами и конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии.
- Результат зависит от подготовки стеклянных капиллярных игл, оснащения микроинъектора и инфраструктуры для флуоресцентной микроскопии.
- Необходима стандартизация параметров инъекций и протоколов диссекции кишечника во всех исследовательских группах для обеспечения согласованности доставки патогена и показателей его локализации.
- Адаптация метода для различных видов клещей или штаммов патогенов может потребовать оптимизации размера иглы, давления при инъекции и концентрации бактерий.
- Практические ограничения включают техническое мастерство, необходимое для успешного проведения микроинъекций и диссекции кишечника, а также необходимость соблюдения второго уровня биобезопасности при работе с патогенами человека.
