Эффективное полиэтиленгликоля (ПЭГ) Опосредованное Преобразование Мосс Physcomitrella patens
19 апреля 2011 г.
Простой и эффективный метод для преобразования Physcomitrella pantens Протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов Physocmitrella Protonemal протопластов и Arabidopsis Мезофильных протопластов преобразования 1.
Общая цель данной процедуры — трансформация протопластов SCO Metre. Это достигается путем первоначального переваривания растений с помощью Drizly. Затем протопласты промывают маннитом для удаления Drizly, после чего их инкубируют с ДНК и ПЭГ.
Наконец, трансформированные протопласты распределяют по планшетам и инкубируют. В итоге можно получить результаты, которые с помощью флуоресцентной микроскопии покажут экспрессию флуоресцентно меченных белков в трансформированных протопластах. Процедуру продемонстрирует Y lu, постдок из моей лаборатории.
Основным преимуществом данного метода является его эффективность и стабильное получение протопластов, экспрессирующих интересующий белок. Для выделения протопластов мха начните с добавления 9 мл 8% маннитола в чашку Петри с помощью шпателя. Поместите мох возрастом от пяти до семи дней с двух-трех чашек с PP NH₄ в маннитол. Рецепты данного и дополнительных реагентов приведены в прилагаемом письменном протоколе. Затем добавьте 3 мл 2% дризли и инкубируйте при комнатной температуре в условиях осторожного встряхивания в течение одного часа.
Профильтруйте смесь через сетку с размером ячеек 100 micron, чтобы получить однородную суспензию зеленого цвета. Затем центрифугируйте фильтрат при 250 G в течение пяти минут. Очень осторожно слейте супернатант.
Ресуспендируйте протопласты в 500 µL 8% маннитола. Затем добавьте еще 9,5 mL 8% маннитола. Убедитесь, что протопласты полностью суспендированы.
Повторите этапы промывки еще два раза, снова центрифугируя раствор при 250 G в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте протопласты, сначала в 500 microliters.
Затем добавьте 9,5 мл 8% маннитола и определите количество протопластов в 10 мкл суспензии с помощью гемоцитометра для последующей трансформации изолированных протопластов ДНК. Сначала центрифугируйте смесь протопластов при 250 G в течение пяти минут.
Удалите супернатант и ресуспендируйте протопласты в растворе MMG до концентрации 1,6 миллиона на миллилитр. Инкубируйте суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем добавьте 600 мкл раствора протопластов в культуральную пробирку, содержащую 60 мкг ДНК. Перемешайте.
Осторожно добавьте 700 µL раствора ПЭГ с кальцием и перемешайте. Тщательно инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 30 минут в этот период ожидания. Накройте планшеты PRMB целлофаном.
Затем разбавьте суспензию тремя миллилитрами раствора W5 и центрифугируйте при 250 G в течение пяти минут. Для удаления ПЭГ ресуспендируйте протопласты в двух миллилитрах PRMT; высейте по одному миллилитру на каждую чашку с PRMB, накрыв их целлофаном. Храните чашки при 25 °C в климатической камере.
Наконец, через четыре дня после трансформации перенесите целлофан на свежие селекционные среды. На данном рисунке показан пример 18-дневных растений, регенерированных из протопластов, трансформированных 15 мкг суперскрученной плазмидной DNA, несущей кассету устойчивости к гигромицину. В данном случае в протопласты были трансформированы 30 мкг той же суперскрученной плазмидной DNA.
В данный образец было трансформировано 60 micrograms плазмидной ДНК. Наконец, эти растения были регенерированы из протопластов, трансформированных 120 micrograms той же суперскрученной плазмидной ДНК, содержащей кассету устойчивости к гигромицину. Эффективность трансформации не зависит от концентрации ДНК до 60 micrograms.
Однако более высокие концентрации ДНК препятствуют успешному выполнению данной процедуры. Данные показывают, что этот метод обеспечивает стабильные результаты в широком диапазоне количества ДНК за один семестр. При правильном выполнении данная методика занимает три часа.
После выполнения данной процедуры можно применить дополнительные методы, такие как транзиентная РНК-интерференция (RNAi) и нокаут генов, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о функциях генов.
Обзор
В данной статье описывается простой и эффективный метод трансформации протопластов Physcomitrella patens. Методика адаптирована на основе существующих протоколов трансформации протопластов и направлена на получение стабильно успешных результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Генная инженерия
- Клеточная биология
Введение
- Протопласты — это растительные клетки, из которых удалены клеточные стенки.
- Методы трансформации имеют важное значение для изучения функций генов в растениях.
- Physcomitrella patens служит модельным организмом в исследованиях растений.
- Существующие методы трансформации протопластов могут быть сложными и трудоемкими.
Цель исследования
- Предоставить оптимизированный протокол трансформации протопластов Physcomitrella patens.
- Повысить эффективность и воспроизводимость трансформации протопластов.
- Обеспечить условия для дальнейших генетических исследований мха.
Используемые методы
- Переваривание тканей мха с помощью Drizly для выделения протопластов.
- Промывание протопластов маннитом для удаления загрязнений.
- Трансформация выделенных протопластов ДНК с использованием ПЭГ.
- Инкубация трансформированных протопластов на селективных средах.
Основные результаты
- Трансформированные протопласты успешно экспрессировали флуоресцентные белки.
- Метод продемонстрировал стабильную эффективность трансформации при различных концентрациях ДНК.
- Было установлено, что более высокие концентрации ДНК отрицательно сказываются на успехе трансформации.
- Вся процедура может быть выполнена примерно за три часа.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к трансформации протопластов Physcomitrella patens.
- Он позволяет проводить последующие эксперименты, такие как транзиентная РНК-интерференция (RNAi) и нокаут генов.
- Этот протокол может существенно помочь в изучении функций генов мха.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
ПЭГ-опосредованная трансформация протопластов Physcomitrella patens обеспечивает эффективную и воспроизводимую доставку генов, что способствует высокопроизводительному функциональному геномному анализу в растительных системах. Эта возможность крайне важна для исследовательских групп на ранних этапах поиска, стремящихся изучить функцию генов, подтвердить мишени и ускорить выяснение путей в генетически доступной модели. Масштабируемость и потенциал стандартизации данного метода делают его ценным инструментом для генетического скрининга всего портфеля проектов и снижения механистических рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает быструю проверку функций генов за счет эффективной доставки ДНК в клетки мха.
- Поддерживает высокочастотный генный таргетинг для функциональной валидации мишеней и анализа путей.
- Способствует снижению механистических рисков, позволяя вносить точные генетические модификации в модельной системе.
- Повышает прогностическую уверенность в отношении последующих биологических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет стандартизированный протокол получения большого количества трансформантов для скрининговых анализов.
- Обеспечивает воспроизводимую эффективность трансформации, поддерживая надежность и масштабируемость анализа.
- Позволяет подготавливать валидированные биологические системы для оценки соединений и фенотипического скрининга.
- Снижает зависимость от специализированного оборудования, повышая доступность для групп по разработке методов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает возможность проведения последующих исследований, таких как переходная РНК-интерференция и изучение нокаута генов, имеющих значение для моделирования заболеваний.
- Поддерживает непрерывность процесса от открытия гена до доклинической валидации в растительных системах.
- Предоставляет платформу для поиска трансляционных биомаркеров при соответствии с путями, имеющими значение для развития заболевания.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол трансформации применим на этапах от начального поиска до идентификации перспективных соединений, что позволяет осуществлять генетические манипуляции, валидацию мишеней и разработку методов анализа на модельных растениях.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей посредством эффективной доставки генов и анализа экспрессии.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализов за счет создания однородных популяций трансформантов.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, такие как эффективность трансформации и уровень экспрессии белка, для проведения сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяют проводить генетические исследования, необходимые для разработки доклинических моделей и идентификации биомаркеров.
- Повторное использование в организации: предлагает широко применимый стандартизированный метод трансформации для различных генетических исследований.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях функций генов.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов генетической трансформации.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежной генерации данных на ранних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение генетических мишеней и путей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток растений и владение методами стерильного выделения и трансформации протопластов.
- Необходим доступ к базовой лабораторной инфраструктуре, включая центрифугирование и флуоресцентную микроскопию для валидации результатов.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров трансформации для обеспечения воспроизводимости результатов в различных проектах.
- Может потребоваться адаптация метода для использования с другими видами растений или модельными системами, помимо Physcomitrella patens.
- Эффективность трансформации зависит от концентрации ДНК, при этом избыточное количество может оказать негативное влияние.
