Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

Целью данной процедуры является получение серии изображений определенного участка ткани головного мозга с помощью фокусированного ионного пучка и сканирующего электронного микроскопа. Это достигается путем предварительного секционирования мозга на срезы, которые затем окрашивают и заливают смолой. На втором этапе интересующий участок вырезают из залитого в смолу среза мозга и монтируют на чистый смоляной блок.

На третьем этапе необходимо обрезать блок смолы с помощью ультрамикротома и использовать ионный пучок микроскопа, чтобы выделить только область, предназначенную для визуализации. Заключительный этап представляет собой серийную визуализацию поверхности блока смолы с использованием ионного пучка для многократного удаления тонких слоев перед каждым снимком. В конечном итоге можно получить результаты в виде серии изображений через область интереса.

Серия изображений собирается автоматически, и набор данных обычно имеет изотропные воксели, что позволяет рассматривать структуры изображения под любым углом в стеке. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как серийная трансмиссионная электронная микроскопия срезов, заключается в возможности достижения гораздо более высокого разрешения по оси Z. А по сравнению с электронной томографией, данный метод позволяет визуализировать гораздо большие объемы при оптимальном разрешении для образцов, залитых смолой.

Процедура начинается с извлечения фиксированного мозга анестезированной крысы после перфузии. Поместите мозг в пластиковую форму с теплым 5% раствором агарозы, расположите мозг под нужным углом до затвердевания агарозы, затем закрепите блок агарозы с мозгом в держателе для образцов вибратома. Вырежьте коронарные срезы толщиной 80 micron в количестве, достаточном для охвата области интереса.

Затем поместите образцы в стеклянные инкубационные флаконы объемом 20 milliliter. Помещайте до 10 срезов в один флакон. Промойте образцы трижды по пять минут в 0.1 molar K coate буфере.

Затем окрасьте образцы 1.5% цианидом калия и 1% тетраоксидом осмия в 0.1 молярном какаоатном буфере в течение 30 минут. Продолжите окрашивание образцов 1% тетраоксидом осмия в 0.1 молярном какаоатном буфере в течение 30 минут. После этого один раз промойте образцы дважды дистиллированной водой в течение трех минут, затем окрасьте 1% ацетатом алюминия в дважды дистиллированной воде в течение 30 минут.

Затем промывайте срезы в течение пяти минут в дважды дистиллированной воде, после чего обезвоживайте их в серии спиртов возрастающей концентрации, выдерживая по две минуты на каждой стадии. Следующий этап — заливка срезов в смоле Duran, смешанной со спиртом, в возрастающих концентрациях с интервалом в 30 минут между сменами растворов. Начните с соотношения этанола к смоле 50 к 50, затем перейдите к 30 к 70, затем к 10 к 90 и, наконец, выдержите срезы в 100% смоле в течение 30 минут.

Затем замените среду на 100% свежую смолу duran. Медленно перемешивайте в течение одного часа на роллерном миксере. После заливки с помощью деревянной зубочистки перенесите срезы на предметные стекла микроскопа, предварительно покрытые разделительными агентами для форм.

Поместите на предметные стекла как можно больше срезов, стараясь при этом не перегружать их. Убедитесь, что между предметными стеклами также размещена идентификационная метка. Поместите стекла в печь при температуре 65 °C на 24 часа.

На следующий день извлеките образцы из печи. Осторожно просуньте лезвие бритвы между стеклами предметных микроскопов и, придерживая слой смолы пальцами, извлеките его из-под стекол вместе с образцами. Аккуратно промойте образец под проточной водой.

Чтобы удалить остатки разделительных агентов для форм, поместите образец под диссекционный микроскоп с проходящим освещением, используя объектив с малым увеличением. Отметьте интересующую область тонкой иглой. С помощью лезвия бритвы вырежьте небольшой квадрат размером 3 мм на 3 мм вокруг исследуемой области.

С помощью акрилового клея прикрепите небольшой блок смолы к верхней части заготовки из смолы. Затем зажмите блок в держателе ультрамикротома. Используя прикрепленный стереомикроскоп, обрезайте материал вокруг интересующей области с помощью лезвия бритвы до тех пор, пока не останется небольшой пирамидальный фрагмент материала.

Обрежьте край блока под углом к его верхней поверхности вблизи области интереса, используя стеклянный нож, закрепленный в ультрамикротоме. Продолжайте подрезать блок до тех пор, пока область интереса не будет точно локализована относительно размеров поверхности блока. Снимите блок с ультрамикротома и поместите его под просвечивающий световой микроскоп.

Сфотографируйте область интереса. Используйте ювелирную пилу, чтобы отрезать подрезанный блок от оставшегося полимерного штока с углеродной краской. Закрепите отделенный блок SA на держателе образцов СЭМ и сориентируйте его таким образом, чтобы сторона, предназначенная для визуализации, была обращена к внешнему краю.

После высыхания клея перенесите препарат в систему напыления и вакуумного испарения и покройте блок тонким слоем золота толщиной более 20 nanometers. Теперь блок ткани, залитый в смолу, готов к визуализации в сканирующем электронном микроскопе с фокусированным ионным пучком. Поместите образец в держателе в микроскоп при низком увеличении и с помощью детектирования вторичных электронов сориентируйте блок так, чтобы область интереса и сторона блока, подлежащая визуализации, были обращены к детектору.

Оператор ориентирует блок таким образом, чтобы поверхность, которую необходимо визуализировать, располагалась параллельно фрезерирующему пучку. В результате электронный пучок ориентируется под углом 54 градуса к этой поверхности при использовании тока ионного пучка от 13 до 27 nano amps. При напряжении 30 kilovolts.

Удалите узкую полосу смолы с передней части области, предназначенной для визуализации. Затем переключитесь в режим получения изображений по обратному рассеянию электронов, чтобы увидеть фрезерованную поверхность, расположенную над областью интереса. Используя полученное ранее эталонное изображение, сделанное с помощью светового микроскопа, и изображение фрезерованной поверхности, определите точную область на блоке для последующего фрезерования и визуализации с использованием системы газового ввода микроскопа.

Нанесите защитный слой углерода или металла толщиной около одного микрона на поверхность блока над областью интереса, используя ток 700 picoamps. В завершение выполните фрезерование области блока, в которой будут получены окончательные изображения. Продолжайте фрезерование поверхности изображения до полного исчезновения артефактов фрезерования на этой поверхности.

Выберите параметры микроскопа для серийной визуализации поверхности. Типичные параметры включают напряжение от 1.2 до 2 кВ при размере пикселя от 4 до 20 нм. Время экспозиции пикселя должно составлять около 10 мкс, чтобы общее время обработки поверхности и получения одного изображения не превышало двух минут.

Оставьте микроскоп в покое минимум на два часа для стабилизации температуры. После этого начните процесс фрезерования и получения изображений для сбора серийных срезов через область интереса. На данном рисунке представлено изображение блока в режиме обратно рассеянных электронов с инверсией контраста, демонстрирующее ультраструктуру области wrap brain.

Все мембраны, а также крупные макромолекулярные структуры хорошо видны. Данный рисунок представляет собой совокупность 1 600 изображений, полученных с шагом в 5 нм, что позволило создать стек изображений с изотропными вокселями. Этот стек можно визуализировать в любой плоскости с одинаковым разрешением.

Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить ткани головного мозга для серийной визуализации с помощью сканирующего электронного микроскопа с фокусированным ионным пучком.