Обнаружение посттрансляционной Изменения по земельному Неповрежденный нуклеосом с помощью ИФА

Общая цель данной процедуры заключается в точном определении относительных уровней посттрансляционных модификаций в препаратах суммарных клеточных нуклеосом, полученных из миллиона клеток. Для этого сначала готовят высококачественные гомогенные культуры клеток млекопитающих. Затем ядра изолируют из клеток путем механического разрушения с помощью гомогенизатора Даунса и центрифугирования.

Следующим шагом является получение интактных нуклеосом путем переваривания хроматина в ядрах и проведения серии гипотонических экстракций. В завершение нуклеосомы анализируют с помощью метода ИФА с соответствующим контролем для идентификации специфических посттрансляционных модификаций. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие относительный уровень специфических модификаций в образцах нуклеосом.

Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как вестерн-блоттинг и иммунопреципитация хроматина, является возможность легко получить общую картину ряда состояний модификации нуклеосом. Этот метод значительно более чувствителен и точен, чем вестерн-блоттинг, и может быть реализован в большинстве лабораторий, оснащенных для проведения общих экспериментов по молекулярной биологии. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток и эпигенетики, например, о том, что происходит при основных процессах дифференцировки и репрограммирования.

Для начала процедуры сначала проведите трипсинизацию клеток, используя 3 мл трипсина на одну чашку диаметром 15 см, чтобы получить свежетрипсинизированные клетки. Добавьте 20 мл ледяного PBS с бутиратом. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте ее для осаждения клеток при 1000 RPM в течение пяти минут, после чего аспирируйте супернатант и добавьте 10 мл ледяного PBS с бутиратом для промывки. Повторно центрифугируйте клеточную суспензию при 1000 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в четырех миллилитрах лизирующего буфера с ингибиторами протеаз, как описано в письменном протоколе. Затем перенесите клетки пипеткой в гомогенизатор с пестиком типа B и проведите гомогенизацию на льду, сделав 20 движений. После этого перенесите гомогенат в центрифужную пробирку на льду.

Центрифугируйте образец при 2000 G в течение 10 минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант, содержащий цитоплазматический материал, и ресуспендируйте осадок.

Ресуспендируйте осадок в двух миллилитрах ледяного промывочного буфера C с ингибиторами протеаз, затем осторожно нанесите ресуспендированный материал поверх пяти миллилитров 30% сахарозной подушки в охлажденной центрифужной пробирке. Для выделения ядер центрифугируйте пробу при 2 400 G в течение пяти минут с использованием ротора с качающимися стаканами; ядра мигрируют сквозь подушку, а клеточный дебрис останется на границе раздела фаз. После центрифугирования осторожно удалите весь объем жидкости и ресуспендируйте ядра в 250 µL ледяного промывочного буфера C с ингибиторами протеаз, после чего перенесите ядра в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Для начала выделения нуклеосом добавьте три микролитра 0.1 молярного хлорида кальция к ядрам и поместите их в термоблок при 37 °C до выравнивания температуры. Затем добавьте две единицы микрококкальной нуклеазы в 10 µL буфера для микрококкальной нуклеазы и инкубируйте в течение 12 минут при 37 °C. Часто перемешивайте содержимое наконечником пипетки.

После инкубации остановите реакцию, добавив 6 µL 0,5 M ЭДТА-pH 8, и поместите образец на лед для охлаждения. Затем центрифугируйте образец при 2000 ×g в течение 4 минут; после центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 300 µL 0,2 mM ЭДТА. Инкубируйте образец на льду в течение одного часа, периодически осторожно перемешивая содержимое с помощью пипетирования.

После центрифугирования при 3000 G в течение четырех минут при температуре 4 °C соберите супернатант, содержащий свободные нуклеосомы, в новую пробирку для центрифугирования и храните на льду для последующего использования нуклеосом. Ресуспендируйте осадок в 300 µL 0,2 мМ раствора ЭДТА натрия, как описано ранее, и инкубируйте на льду в течение одного часа, периодически аккуратно перемешивая.

После инкубации центрифугируйте образец. Снова объедините полученный супернатант с оставшейся частью образца в микроцентрифужной пробирке на льду. Для начала проведения ИФА-анализа нуклеосом заполните 96-луночный планшет для ИФА серией из пяти двукратных последовательных разведений нуклеосом в буфере для покрытия, начиная с концентрации 0,1 µg на 50 µL в верхней лунке; все серии разведений должны быть внесены в трех повторностях.

Не забудьте включить лунки, содержащие только буфер для покрытия, в качестве контролей. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 4 °C. Используя мойку для планшетов, промойте планшеты 200 µL на лунку 0,5% между 20 в PBS при комнатной температуре четыре раза в течение в общей сложности 10 минут.

Теперь добавьте по 100 µL блокирующего раствора в каждую лунку и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре на ротаторе. После инкубации удалите блокирующий буфер, энергично встряхнув перевернутый планшет над раковиной. Затем добавьте разведенные первичные антитела в объеме 50 µL на лунку в растворе 5% PSA в 0,05% between 20 в PBS и инкубируйте раствор в течение одного часа на ротаторе при комнатной температуре.

После инкубации с первичными антителами промойте планшеты, как указано ранее, используя мойку планшетов. По завершении процедуры промывки добавьте в каждую лунку по 50 µL вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и разведенных в PBS с 5% BS, A, и 0.5%20; инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре на ротаторе. После инкубации со вторичными антителами промойте планшеты, как указано ранее.

Используйте мойку планшетов для проявки планшета. Добавьте 50 µL TMB-субстрата для ELISA в каждую лунку и инкубируйте в течение 10 минут. При комнатной температуре содержимое лунок ELISA-планшета окрасится в синий цвет, причем интенсивность окраски будет пропорциональна количеству модификаций нуклеосом в каждой из них.

После этого остановите реакцию, добавив в каждую лунку по 50 µL 2Н серной кислоты. Цвет изменится на коричневый. Центрифугируйте планшет при 1500 об/мин в течение двух минут, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Теперь планшет готов к количественному определению на колориметрическом планшетном ридере. В завершение измерьте оптическую плотность планшета при 450 нанометрах и экспортируйте результаты для анализа. При должном освоении и правильном выполнении после этапа разработки данную методику можно реализовать за два дня.

Этот метод открыл исследователям в области стволовых клеток возможность изучать эпигенетические ответы на процессы дифференцировки и репрограммирования на уровне всего эпипротеома.