Изготовление микрожидкостных Устройство для дробления Нейрон Сома и Аксоны
22 августа 2007 г.
В этом видео мы продемонстрируем технику мягкой литографии с полидиметилсилоксан (PDMS), который мы используем, чтобы farbricate микрожидкостных устройство для культивирования нейронов.
Добро пожаловать в лабораторию доктора Ньюли Джона. Лаборатория Джона специализируется на разработке микрофлюидных платформ для биологических приложений. В этом видео мы продемонстрируем изготовление и использование микрофлюидного устройства, предназначенного для компартментализации и культивирования первичных нейронов.
Устройство для нейронов было впервые опубликовано в журнале Nature Methods в августе 2005 года. С момента своего появления устройство для нейронов широко используется исследователями по всему миру. Устройство для нейронов состоит из фрагмента PDMS, отлитого на кремниевой пластине с паттерном SUA устройства, который был предварительно создан методом фотолитографии.
Устройство имеет три основные характеристики: четыре резервуара диаметром 8 мм, два основных канала шириной 1,5 мм, длиной 7 мм и высотой 100 мкм, а также микроканавки шириной 10 мкм и высотой 3 мкм, которые соединяют два основных канала. Длина микроканавок может варьироваться от 150 мкм до 900 мкм, хотя стандартное выбранное значение составляет 450 мкм. Если расположить устройство так, чтобы основные каналы и микроканавки находились вертикально, видно, что резервуары слева от канавок соединены через основные каналы, так же как и резервуары справа.
Эта особенность позволяет жидкости протекать через основной канал, что крайне важно для загрузки клеток и смены среды. Устройство для нейронов имеет три основных преимущества перед традиционными платформами для культивирования тканей. Во-первых, оно позволяет разделять тела клеток (сомы) и аксоны. С помощью данного устройства можно получить чистые аксональные фракции.
Размер и длина микроканавок позволяют аксонам проходить через основной канал, препятствуя при этом пересечению тел соматических клеток. Во-вторых, благодаря конструкции устройства и использованию гидростатического давления, можно подвергать воздействию отдельных препаратов либо сторону с клетками, либо сторону с аксонами, просто поддерживая больший объем жидкости в резервуарах с одной стороны устройства по сравнению с другой. И в-третьих, фракцию устройства, содержащую исключительно аксоны, можно отсечь с помощью вакуумного всасывания, что позволяет исследователю изучать и наблюдать за регенерацией аксонов.
Исследователь Хина Ли продемонстрирует процесс подготовки микрофлюидного устройства для нейронов. Для отливки полидиметилсилоксановой (PDMS) микрофлюидной формы используется кремниевая пластина толщиной 3 Å с рисунком из SU-8, созданным методом фотолитографии. Мы называем кремниевую пластину с рисунком SU-8 мастер-формой или просто мастером.
PDMS смешивают с отвердителем в весовой пропорции 10:1. Например, берут 15 г PDMS на 1,5 г отвердителя. После этого PDMS тщательно перемешивают и выливают на кремниевую подложку.
Кремниевая пластина помещена в полистирольную чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Для покрытия микроструктур (MAs) слоем толщиной примерно четыре миллиметра требуется от 12 грамм до 15 грамм PDMS. Затем мастер с нанесенным PDMS помещают в вакуумный эксикатор с открытой крышкой чашки Петри и создают вакуум.
Это делается для того, чтобы удалить пузырьки воздуха из PDMS, которые появились во время перемешивания отвердителя. Процесс удаления пузырьков воздуха занимает приблизительно 15 минут. Спустя 15 минут пребывания в вакуумном эксикаторе мастер с PDMS извлекают из него.
На мастер-форме из PDMS все еще осталось несколько пузырьков. Для удаления оставшихся пузырьков используется воздушный пистолет с фильтром 0,45 мкм. Затем форму помещают на нагревательную поверхность при температуре 80 °C на один час для отверждения.
Если вакуумный эксикатор недоступен, смесь можно оставить при комнатной температуре на несколько часов. Пузырьки воздуха со временем исчезнут сами по себе. Если в наличии нет нагревательной плитки, PDMS полимеризуется при комнатной температуре через 24 часа.
Важно убедиться, что мастер-форма находится в горизонтальном положении в процессе отверждения. После отверждения PDMS на мастер-форме образец переносят в чистый бокс, используя хирургический скальпель. По периметру устройств делается круговой надрез.
При введении лезвия в PDMS для установления контакта с кремниевой подложкой важно не оказывать на нее чрезмерного давления, иначе мастер-матрица может треснуть, и вокруг устройств образуется круговой разрез. На каждой трехдюймовой кремниевой мастер-матрице расположены четыре устройства. После этого PDMS осторожно отделяют от мастер-матрицы.
Этот процесс можно начать, осторожно поворачивая хирургический скальпель при его введении в ранее сделанный разрез. Устройства из PDMS на форме очень тонкие. Резервуары, обращенные лицевой стороной вверх, высекаются в устройстве с помощью восьмимиллиметрового просекателя для биопсии тканей.
Остатки материала, оставшиеся в пробойнике, выталкивают стержнем. Затем устройства разрезают на четыре части и обрезают излишки PDMS, чтобы устройство аккуратно помещалось на покровное стекло Corning. Для удаления остатков мусора используется сжатый азот, стекло номер один размером 24 millimeter by 40 millimeter.
Стойкие загрязнения также можно удалить с помощью виниловой ленты 3M Scotch Brand 4 7 1. Теперь очищенные устройства готовы к плазменному склеиванию. Для кратковременного приклеивания нейронных устройств к покровным стеклам используется плазменный очиститель Herrick.
Устройства и покровные стекла помещают на лоток, который затем устанавливают в установку для плазменной очистки, после чего с помощью вакуумного насоса откачивают воздух из камеры. Важно отметить, что устройства из PDMS следует располагать лицевой стороной вверх. То есть стороной с рисунком канала вверх, чтобы они подверглись воздействию плазменного газа.
После того как вакуумное давление достигнет 300 millitorr, подается питание на электрическую катушку и устанавливается высокая мощность. Дверца приоткрывается, чтобы в камеру попало небольшое количество воздуха, что поможет создать плазму. Устройства и покровное стекло подвергаются плазменной обработке в течение двух минут.
Обратите внимание на фиолетовый цвет в камере. Это и есть плазма. Электрическая катушка создает плазму, которая представляет собой частично ионизированный газ, состоящий из электронов, ионов и нейтральных атомов или молекул.
Плазма создает активные частицы на поверхности стекла и устройства, которые при их совмещении образуют прочную связь. Плазма также делает поверхность гидрофильной, что облегчает нанесение жидкостей. Очистка плазмой также стерилизует устройства.
После двухминутной плазменной обработки питание вакуумной системы отключают и в камеру подают воздух. Очищенные плазмой поверхности стекла и микрофлюидного устройства соединяют друг с другом в ламинарном шкафу. Затем устройства помещают в стерильные чашки диаметром 60 миллиметров.
Поверхности стекла и устройства, обработанные плазмой, образуют прочную необратимую связь. В течение 10 минут после плазменного соединения устройства со стеклом к устройству добавляют поли-L-лизин. Через 10 минут гидрофильность устройства снизится.
Это затрудняет попадание PLL в устройство. После добавления PLL важно проверить устройство на наличие пузырьков воздуха. Простым способом удаления имеющихся пузырьков воздуха является использование пипетки P 200, заполненной 100 µL жидкости.
В данном случае поместите кончик пипетки с PLL непосредственно в отверстие основного канала, затем с силой нажмите на P 200. Эту процедуру может потребоваться повторить несколько раз, но в конечном итоге давление пипетки вытолкнет пузырьки воздуха. Устройства, содержащие PLL, оставляют инкубироваться на ночь в стандартном инкубаторе для культивирования тканей при 37 °C с 5% CO2.
После 24 часов инкубации с PLL устройства дважды быстро промывают автоклавированной деионизированной водой. В ходе этого процесса жидкость не удаляют полностью из основных каналов, только из резервуаров. Удаление жидкости из основных каналов приведет к появлению пузырьков.
После двух быстрых промывок устройства снова заполняют автоклавированной деионизированной водой и помещают обратно в инкубатор минимум на три часа или на ночь. На следующий день, после инкубации устройств в воде в течение ночи или минимум трех часов, их снова переносят в бокс биологической безопасности и дважды промывают деионизированной водой. Затем в устройства добавляют базальную среду для нейронов, содержащую необходимые добавки: B 27 и глутамат для культивирования первичных нейронов крысы.
Затем устройства помещают обратно в инкубатор для дальнейшего использования. Теперь устройства готовы к высеву нейронов. В данном видео мы продемонстрировали метод мягкой литографии, который мы используем для изготовления наших нейронных устройств.
Эти устройства могут быть использованы для культивирования нейронов и других интересующих типов клеток. Основным преимуществом данных устройств является возможность разделения и компартментализации культур: тела нейронов располагаются на одной стороне устройства, а чистая аксональная фракция — на другой. В следующем видео мы продемонстрируем процесс подготовки кортикальных нейронов эмбрионов крыс на стадии E 18 и способ загрузки клеток в устройство.
На этом всё, что касается лаборатории Джона. Спасибо за просмотр.
Обзор
В этом видео демонстрируется метод мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) для изготовления микрофлюидного устройства для культивирования нейронов. Данное устройство позволяет разделять тела нейронов и их аксоны по разным отсекам, что способствует проведению углубленных исследований в области нейробиологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Микрофлюидика
- Методы культивирования клеток
Введение
- Устройство для нейронов было впервые опубликовано в журнале Nature Methods в августе 2005 года.
- Оно получило широкое распространение среди исследователей по всему миру.
- Устройство изготовлено из PDMS, отлитого на кремниевой пластине.
- Оно оснащено резервуарами и каналами, предназначенными для культивирования нейронов.
Цель исследования
- Продемонстрировать изготовление микрофлюидного устройства для культивирования нейронов.
- Осветить преимущества использования данного устройства по сравнению с традиционными платформами для культивирования тканей.
- Представить детальную методику подготовки устройства для нейронов.
Используемые методы
- Смешивание PDMS с отвердителем в определенном соотношении.
- Использование вакуумного эксикатора для удаления пузырьков воздуха из PDMS.
- Отверждение PDMS на нагревательном планшете или при комнатной температуре.
- Плазменное соединение устройств из PDMS с предметными стеклами для расширения функциональности.
Основные результаты
- Устройство позволяет разделить тела нейронов и аксоны по разным отсекам.
- Оно обеспечивает возможность раздельного воздействия на разные отделы.
- Исследователи могут получать чистые аксональные фракции для анализа.
- Конструкция облегчает наблюдение за регенерацией аксонов.
Выводы
- Микрофлюидное устройство для нейронов является ценным инструментом для исследований в области нейробиологии.
- Оно предоставляет значительные преимущества для изучения поведения и регенерации нейронов.
- Процесс изготовления подробно описан и воспроизводим для исследователей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Камертиментированные микрофлюидные платформы обеспечивают точный пространственный контроль над субпопуляциями нейронов, что способствует валидации мишеней в моделях нейродегенеративных заболеваний. Благодаря изолированию отделов сомы и аксона, такие системы позволяют снизить механистические риски при оценке терапевтических кандидатов посредством специфического для каждого компартмента воздействия и анализа результатов. Этот подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет снижения биологического шума и повышения специфичности анализа в исследованиях аксональной регенерации и нейропротекции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем изоляции аксональных и соматических компартментов для их независимого воздействия.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством специфического воздействия на компартменты и анализа целостности аксонов.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность результатов анализа ведущих соединений за счет снижения влияния мешающих сигналов от тел клеток в аксональных тестах.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных нейронных систем для последующего скрининга соединений с компартментализированным считыванием показателей.
- Практическая ценность: Стандартизация изоляции аксонов и условий культивирования, что повышает воспроизводимость в ходе кампаний по скринингу.
- Масштабируемость: Обеспечение возможности повторного использования платформы для различных мишеней и терапевтических методов в исследованиях в области нейронаук.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Сохранение релевантной для заболевания архитектуры нейронов на всех этапах — от открытия до доклинической валидации.
- Механистическое снижение рисков: Возможность оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей в аксонах без влияния соматических факторов.
- Продвижение с учетом рисков: Поддержка принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе фенотипов регенерации или дегенерации аксонов.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Микрофлюидное устройство для нейронов интегрируется в общий цикл разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, обеспечивая возможность анализа отдельных компартментов на каждом этапе.
- Биологические исследования: обеспечивают проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов за счет изоляции аксональных ответов на терапевтические воздействия.
- Скрининг: гарантирует готовность анализа и количественные показатели аксонов для надежной оценки соединений в программах по изучению нейродегенерации.
- Аналитика: позволяет получать измерения, специфичные для конкретных компартментов (например, вырост или дегенерация аксонов), что обеспечивает объективное сравнение условий лечения.
- Трансляционные исследования: связывают этап первичного поиска с доклиническими исследованиями за счет сохранения полярности нейронов и возможности проведения аксональных анализов, согласованных с биомаркерами.
- Корпоративное использование: служит многократно используемой платформой для различных проектов, что снижает затраты на повторную разработку и обеспечивает согласованность моделей нейронов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования за счет снижения механистической неопределенности при сравнении аксональных и сомальных ответов.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов компартментализации нейронов.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних этапах в портфелях препаратов для лечения нейродегенерации.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию с учетом рисков на основе профилей эффективности и безопасности для конкретных компартментов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области проектирования микрофлюидных систем, работы с PDMS и методов стерильного культивирования клеток.
- Зависит от наличия плазменных очистителей, вакуумных эксикаторов и инструментов прецизионного изготовления для подготовки мастер-форм.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов изготовления и контроль качества для обеспечения единообразия характеристик устройств.
- Требуются адаптационные корректировки при переходе к нейронам, полученным из иПСК человека, или к моделям заболеваний с измененной динамикой нейритов.
- Включает такие практические ограничения, как загрязнение устройств при длительном культивировании и необходимость обновления среды для предотвращения образования пузырьков в каналах.
