Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

В данном протоколе демонстрируется способ визуализации динамических процессов в эмбрионах *C. elegans* на ранних стадиях развития с помощью оптики DIC Norky или флуоресцентной микроскопии с использованием широко доступных микроскопов и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Протокол начинается с описания того, как препарировать эмбрионы *C. elegans* и фиксировать их для визуализации. Затем рассматривается правильная настройка оптики DIC Norky для получения оптимальных изображений с максимальной детализацией.

Также рассматривается калибровка широкопольного эпифлуоресцентного освещения для сбора качественных данных флуоресцентных изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом. Качественная микроскопия позволяет визуализировать клеточную динамику в развивающемся эмбрионе. Визуальные иллюстрации этого метода имеют решающее значение, так как правильная настройка оптики DIC затруднена из-за неоднозначности терминологии и сложности описания правильной техники в письменном виде.

Кроме того, исследователям следует стремиться к минимизации воздействия света при проведении флуоресцентной визуализации. Чтобы ограничить фототоксичность и фотовыгорание, для подготовки эмбрионов к визуализации сначала необходимо приготовить два фиксирующих раствора. Один из них — расплавленный вазелин, другой — 2–3% раствор agarose в буфере.

Если визуализируемые структуры очень хрупкие, можно приготовить более плотные ARO, стараясь при этом не допустить кипения. Оба исходных раствора расплавляют в микроволновой печи, а затем хранят в виде аликвот по 4–5 мл. В день проведения визуализации расплавляют одну аликвоту раствора вазелина в термоблоке при температуре 65–70 °C и одну аликвоту раствора ARO в микроволновой печи.

Снова избегайте кипения. Затем, чтобы поддерживать эти растворы в расплавленном состоянии, храните их в термоблоке. Далее наклейте полоски лабораторного скотча на верхнюю и нижнюю стороны двух предметных стекол и поместите чистое предметное стекло между двумя стеклами с лентой.

Теперь нанесите несколько капель расплавленного агароза на чистый предметное стекло и накройте его другим чистым предметным стеклом. Агароза растекается, образуя тонкий квадратный слой, таким образом подготавливается площадка для червей. С помощью диссекционного микроскопа и платиновой петли перенесите двух взрослых червей в каплю буфера объемом от 9 до 12 µL на покровное стекло размером 18 × 18 мм.

Затем сделайте разрез. Вскройте червей с помощью иглы или скальпеля, чтобы высвободить эмбрионы, расположив их стороной с агаром вниз. Поместите подложку с червями на покровное стекло размером 18 на 18 мм и удалите лезвием излишки агара по краям.

Наконец, чтобы загерметизировать покровное стекло, нанесите расплавленный раствор вазелина по его периметру с помощью кисточки или зубочистки. Теперь клетки готовы к визуализации. При установке предметного стекла в микроскоп убедитесь, что два поляризатора расположены перпендикулярно друг другу.

Убедитесь, что и диафрагмы, и призмы выведены из светового пути. Если поле зрения не темное, вращайте поляризатор под конденсором до достижения темноты. Найдите эмбрионы, используя объектив с 10-кратным увеличением.

Ищите группы молодых эмбрионов рядом с телами червей, чтобы в поле зрения попало несколько эмбрионов. Для получения наилучших изображений избегайте эмбрионов, находящихся внутри червя. После нахождения наиболее подходящих эмбрионов переключитесь на объектив с большим увеличением.

Теперь переключите куб фильтра в режим DIC. Затем введите верхнюю призму Уолстона объектива в световой путь и поверните диск на конденсоре, чтобы выбрать нижнюю призму Уолстона, соответствующую объективу. После установки призм отрегулируйте ползунок под этой турелью в соответствии с числовой апертурой линзы.

Для достижения оптимальной освещенности по Кёлеру фокусируйте конденсор до тех пор, пока край диафрагмы конденсора не станет максимально четким. Максимальная четкость достигается тогда, когда граница между светлой и темной областями становится наиболее резкой или находится в фокусе. Для получения оптимального контраста отрегулируйте положение стенки и призмы, поворачивая ручку на слайдере.

Теперь микроскоп почти готов к работе. Пришло время настроить дополнительные параметры визуализации на компьютере с помощью MicroManager и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Начните с установки усиления камеры на ноль.

Затем переключите режим сохранения файлов на 8-битные, а не 16-битные TIFF. Файлы TIFF в дальнейшем можно анализировать с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как Image J. Далее отрегулируйте уровень освещенности так, чтобы самые яркие пиксели находились чуть ниже уровня насыщения. Если все действия были выполнены правильно, изображение будет выглядеть объемным, как будто свет падает под углом.

Теперь, когда изображение выглядит четким, выберите эмбрионы, которые необходимо сфотографировать, и очертите область интереса. Если микроскоп оснащен мотором фокусировки, используйте его для сбора данных в нескольких фокальных плоскостях в каждый момент времени. Откройте окно многомерного сбора данных и установите верхнюю и нижнюю плоскости Z-стека, вращая ручку фокусировки, чтобы найти первую и последнюю фокальные плоскости, в которых видны желточные гранулы.

Установите размер шага. Это определит количество собираемых фокальных плоскостей. Теперь установите временной интервал, достаточный для получения всех фокальных плоскостей.

Максимальное время съемки можно установить на очень большое значение, чтобы программное обеспечение продолжало делать снимки до ручной остановки. Настройте программу так, чтобы отображалось только последнее полученное изображение для мониторинга процесса. Теперь присвойте файлам изображений имя и начните захват изображений.

Анализ изображений будет кратко рассмотрен в конце следующего раздела. Создание видеозаписи GFP во многой мере похоже на получение четырехмерных DIC-изображений Musky, однако используется конфигурационный файл, обеспечивающий программное управление флуоресцентным затвором. После позиционирования эмбрионов убедитесь, что верхняя призма Вальстона не находится на пути светового луча, и переключите фильтр-куб на F-I-T-C-G-F-P.

Если этот параметр не был установлен автоматически при запуске программного обеспечения, убедитесь, что усиление камеры установлено на 255. Файл изображения должен быть в 16-битном формате tiff. Теперь выключите источник проходящего света и нажмите «live imaging».

Отрегулируйте интенсивность источника УФ-излучения и время экспозиции, чтобы добиться оптимального соотношения сигнал/шум для флуоресцентного сигнала, при этом поддерживая минимальную экспозицию для сохранения жизнеспособности клеток. Затем установите временной интервал. Определите количество временных точек и количество фокальных плоскостей, после чего приступите к сбору изображений, как было описано ранее.

Для анализа видеозаписей используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом — Image J с установленным плагином micromanager. Очень объемные видеофайлы также можно импортировать в Image J с помощью плагина loci. На данном примере представлен эмбрион дикого типа, снятый с использованием nor masky и оптики DIC.

Задняя часть расположена справа внизу, вентральная — слева внизу. В видео представлена последовательность изображений в одной фокальной плоскости, полученных каждые 15 секунд. Скорость воспроизведения установлена на уровне 14 кадров в секунду.

Этот эмбрион проявляет флуоресценцию во время первого дробления; здесь задний полюс расположен в верхней правой части. В данном видео показаны изменения в одной фокальной плоскости каждые 10 секунд. После просмотра этого видео вы должны четко представить, как проводить визуализацию живых эмбрионов, используя как оптику DIC Naski, так и эпифлуоресценцию для изучения динамических процессов.

Мы надеемся, что теперь вы лучше понимаете, как настроить оптику DIC Nomar для получения оптимальных изображений, и осознаете, что можете получать высококачественные флуоресцентные данные, используя эпифлуоресцентную иллюминацию, и не всегда зависите от более сложных микроскопов. Вы также можете применять эти методы визуализации для исследования эмбрионов с нарушением функций специфических генов, чтобы глубже изучить генетические требования к интересующим вас событиям в процессе деления клеток или развития.