Карт и применение Enhancer-ловушки Выражение Flippase в личинок и взрослых Drosophila ЦНС

Общая цель следующего эксперимента заключается в уточнении экспрессии GAL4 с помощью тканеспецифичной липазы и инструментов конверсии GAL80. Это достигается путем создания коллекции трансгенных линий мух с ловушками энхансеров (ET-FLP) и определения паттерна экспрессии липазы в ЦНС для каждой линии. С использованием GFP-репортера, иммунохимический анализ и отчеты по GFP позволяют дифференцировать глиальную экспрессию от нейрональной, чтобы пересечь экспрессию GAL4 в интересующих линиях ET-FLP с мухами, содержащими инструмент конверсии GAL80 в потомстве.

Клональный анализ может быть использован для исследования уточнения экспрессии GAL4, например, в глазу. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами является то, что линии на основе треков энхансеров совместно с инструментами конверсии GAL80 могут быть использованы с обширной коллекцией линий GAL4, уже доступной в сообществе дрозофилистов. Кроме того, эта концепция может быть расширена на другие модельные организмы, в которых реализована система GAL4/UAS, такие как zebrafish.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы при картировании нейронных цепей, лежащих в основе поведения. Несмотря на то, что в данном протоколе демонстрируется использование flip-базы в определенной группе фоторецепторных клеток, интерсекционный метод может быть применен для анализа других тканей, включая ненейронные ткани, по мере характеристики новых линий с ловушками-энхансерами липазы.

Система GAL4/UAS представляет собой важный метод, широко используемый биологами, изучающими дрозофил. Одной из проблем большинства линий GAL4 является слишком широкая экспрессия, что затрудняет картирование поведения мозга с помощью методов активации и ингибирования. Чтобы частично ограничить экспрессию линий GAL4 в интересующих клетках, перед применением необходимо использовать трансген FLEx/FRT (flip-out).

Для начала полезно изучить паттерн экспрессии трансгена ET flip x two у личинок на поздних стадиях развития и у взрослых особей, чтобы визуализировать экспрессию flip в ЦНС. Для получения потомства проведите скрещивание самцов с интересующим трансгеном ET t flip X two и неспаривавшихся самок, несущих GFP-репортер экспрессии et flip. Для диссекции соберите блуждающих личинок F1 третьей стадии. Поместите их в чистую чашку для С-guard, удалите весь мусор с помощью кисточки и один раз промойте чашку 1× PBS.

Теперь наполните чашку ледяным 1× PBS, чтобы анестезировать личинок. Чтобы получить доступ к ЦНС личинки, зажмите ее ротовой крючок пинцетом. Захватите кутикулу рядом с выходящим передним сферитом и оттяните ее назад. ЦНС остается прикрепленной к ротовому крючку вместе с некоторыми другими структурами.

Теперь с помощью пинцета удалите все избыточные структуры, окружающие ЦНС, в процессе ее препарирования. Переносите их по отдельности в чашку Pyrex с PBS. После того как вся ЦНС будет препарирована, зафиксируйте ее, полностью погрузив в 200 µL 4% PFA на льду.

Если ЦНС всплывает, это означает, что она не была полностью очищена от окружающих тканей. В таком случае с помощью пинцета снова погрузите ЦНС в фиксатор на 15 минут, промойте ткань ледяным PBS 3 раза, а затем промойте ткань еще три раза в ледяном PBT. Теперь ткань готова к визуализации, иммуномаркировке антителами или к хранению в PBT при температуре четырех градусов Цельсия до дальнейшего использования.

Для сбора взрослых особей поколения F1 перед диссекцией использовали те же скрещивания, которые применялись для получения личинок. От 5 до 10 мух погружали в охлажденный 95% ethanol на 30 секунд для удаления воска с поверхности кутикулы. Для удаления ethanol взрослых особей трижды промывали ледяным 1× PBS; после третьей промывки одну из особей переносили в 35-миллиметровую чашку Sil Guard, наполненную ледяным 1× PBS, для подготовки к диссекции.

Положите образец брюшной стороной вверх и вставьте булавку-минион посередине брюшка. Начните препарирование, удалив ноги с помощью пинцета. Затем снимите кутикулу головы, зафиксировав голову в зажимах и одновременно отделяя кутикулу от области под глазом в направлении к макушке.

Осторожно, используя заостренный пинцет, удалите трахеальные ткани вокруг мозга, так как трахеи обладают сильной автофлуоресценцией и заставляют мозг всплывать во время фиксации. Мозг составляет лишь часть ЦНС взрослой особи. Другая часть — брюшная нервная цепочка (VNC) в грудном отделе, которая также должна быть препарирована.

Во-первых, удалите грудную кутикулу, зафиксировав муху у основания задней ноги и осторожно потянув грудную кутикулу до основания шеи. Во-вторых, чтобы обнажить VNC, аккуратно раздвиньте две половины грудной кутикулы. В-третьих, отделите брюшко от груди, зафиксировав насекомое у основания второй ноги и потянув брюшко в сторону от первого сегмента брюшка.

В-четвертых, очистите VNC, закрепив его в области плеча и аккуратно удалив окружающие VNC ткани. Разорвите кольцо соединительной ткани, окружающей шейную соединительную ткань, и продолжайте удалять излишки тканей в процессе извлечения мозга. Перенесите мозг и VNC парами в чашку Pyrex объемом 9 мл, наполненную охлажденным 1× PBS и помещенную на лед.

Для фиксации тканей взрослых особей погрузите их в 4% PFA на льду на 15 минут. После этого проведите три промывки в ледяном PBS и три промывки в PBT. Теперь ткань готова к визуализации или окрашиванию антителами для точного анализа экспрессии трансгена.

Для создания системы координат полезно пометить ЦНС нейрональными или глиальными маркерами; начните с инкубации ткани при температуре 4 °C в течение ночи с антителами к нейронам или глии. На следующий день пять раз промойте препарат раствором PBT и инкубируйте с флуоресцентными вторичными антителами при комнатной температуре в течение двух часов. По завершении инкубации оберните планшет фольгой для предотвращения фотообесцвечивания антител.

Промойте препарат раствором PBS и зафиксируйте его на предметном стекле целиком. Используйте пластиковое кольцо OSHA, чтобы предотвратить сдавливание ткани покровным стеклом. Теперь нервная система готова к изучению паттернов экспрессии GFP и LL с помощью флуоресцентного микроскопа.

Обычно исследуют от трех до пяти повторностей, чтобы определить воспроизводимость паттерна экспрессии flip. Паттерн экспрессии flip в линии flip, a может быть использован вместе с другими трансгенами для изменения способа экспрессии репрессора GAL four GAL 80. Изменение экспрессии репрессора GAL 80 является эффективным методом внесения изменений.

При использовании системы экспрессии GAL4 одним из методов является делеция (flip-out) экспрессии GAL80; при этом трансген GAL80 инактивирует GAL4, который в противном случае вызывает дегенерацию во всем глазу. Здесь используется линия ET flip hash 6 88 A для оценки эффективности инструмента конверсии GAL80 в подмножестве фоторецепторов у потомства F1 путем сравнения фенотипа глаза с фенотипами родительских линий. Любые признаки деформации глаза или депигментации подтверждают наличие паттерна экспрессии flip в фоторецепторах и успешное удаление (flip-out) GAL80.

Дополнительной недублирующей стратегией является инверсия экспрессии GAL 80 с использованием той же интересующей линии flip. Эта стратегия очень похожа на предыдущую, но теперь пигментация ID и дегенерация у потомства F1 подавлены. В flip X два.

Экспрессия фоторецепторов. После освоения техники препарирование ЦНС может быть выполнено примерно за пять минут для взрослых особей и за одну минуту для личинок при условии правильного выполнения процедуры. При проведении данной манипуляции важно использовать острый пинцет для удаления трахей и окружающих тканей как у взрослых особей, так и у Libre C и Ss. Для препарирования необходимо использовать чашку без фиксатора. Для генерации случайных клонов в настоящее время используется метод теплового шока (Heat shock flip).

Напротив, система enhancer trap flip позволяет получать воспроизводимые клоны, что облегчает морфологический и поведенческий анализ. Еще одним преимуществом метода finger является возможность дальнейшего ограничения паттернов экспрессии GAL4 путем использования дополнительных линий на основе anan trap flip и других линий gal. Недостатком конфигурации tubulin stop GAL80 является то, что определенные комбинации эффекторов GAL4 и UAS, таких как LAG4 и U-A-S-K-I-R, несовместимы, так как они приводят к гибели мух.

Эту проблему можно легко решить, используя условный UAS-эффектор, такой как UAS Shiri Ts, который позволяет изучать поведение при рестриктивных температурах. Как и ожидалось, не все линии с энхансер-ловушкой липазы будут экспрессировать липазу в достаточном количестве для практического применения. Тем не менее, описанный здесь метод «пальца» предлагает исследователям Drosophila новый подход к уточнению мозаичного анализа как для изучения цепей развития, так и для анализа поведения.