Порядок легких инженерных

Общая цель данной процедуры заключается в создании в культуре легочной ткани, которая морфологически и физиологически сопоставима с нативной легочной тканью. Это достигается путем первоначального извлечения сердца и легких взрослой крысы. Следующим этапом является канюляция легочной артерии и трахеи с последующим подключением канюлированных легких к биореактору для децеллюляризации.

После децеллюляризации и промывки легкое переносят в стерильный культуральный биореактор и подготавливают к заселению. Заключительным этапом процедуры является заселение нужного отдела легкого подготовленной популяцией клеток. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что децеллюляризированный внеклеточный матрикс эффективно заселен клетками, экспрессирующими регионально-специфические маркеры легких, что подтверждается методом иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами культивирования клеток легкого in vitro является то, что клетки сохраняют дифференцированные фенотипы в течение длительного времени, что позволяет изучать их на протяжении нескольких недель в трехмерном субстрате биологического происхождения. Для децеллюляризации легкие соединяют с крышкой биореактора с помощью сосудистой канюли, а крышку — с установкой для децеллюляризации. Стеклянная бутыль над легкими удерживается штативом с помощью зажима.

На данном этапе клеточный материал можно удалить для создания каркаса из внеклеточного матрикса, который затем можно повторно заселить клетками. Схема сборки биореактора для посева и культивирования инженерной легочной ткани представлена на данном диаграмме. Коннектор Люра-лок трахеальной канюли соединяется с дыхательным контуром между резервуаром трахеи и основной камерой.

Дыхательный контур включает два односторонних клапана. Они расположены таким образом, что среда следует по разным путям при поступлении в легкое и выходе из него. В перфузионную линию временно встроен небольшой резервуар для посева эндотелиальных клеток.

Пульсирующий насос используется для перемещения клеток из резервуара в сосудистый отдел легкого. Перфузия сосудов осуществляется с помощью перистальтического насоса. Среда подается в легочную артерию через подключенную канюлю, проходит через сосудистую сеть легкого и выходит из легочной вены непосредственно в основной биореактор, откуда среда забирается для перфузии.

Легочный эпителий помещают путем инъекции в дыхательный контур. Основная камера, содержащая легкое, и резервуар для трахеи используются для длительного культивирования легких. После извлечения легких и правильной канюляции артерии и трахеи свежеизвлеченные легкие должны удерживать воздух без утечек.

Это можно проверить, надувая их воздухом при погружении в жидкость. Пузырьков, указывающих на утечку воздуха, быть не должно. Для начала протокола легкие наполняют PBS, содержащим нитропруссид натрия, до полного заполнения, избегая гипервентиляции; затем следует немедленно закрыть канюлю трахеи, чтобы легкие оставались в раздутом состоянии.

Затем проведите перфузию легких раствором PBS и SNP в течение не менее 15 минут при давлении 15 мм рт ст. После этого извлеките пробку из трахеальной канюли, чтобы легкие могли спасться. При необходимости продолжите перфузию раствором PBS и SNP в течение 15–30 минут.

Долейте PBS и SNP, чтобы поддерживать давление перфузии на уровне от 10 до 15 мм ртутного столба. Для начала процедуры длительной децеллюляризации крышка биореактора подключается к аппарату для децеллюляризации. Затем к крышке подключают легкие.

Используя соединения Luer-Lock, присоединенные к Y-образному канюле, канюлю легочной артерии следует подключить к линии перфузии, а трахеальную канюлю оставить свободной. Для обеспечения полной децеллюляризации ткани крайне важно не допускать попадания воздуха в систему. Односторонние клапаны в артериальной и трахеальной канюлях помогают удалить пузырьки воздуха из трубок, обеспечивая возможность реверсивного потока в трубках.

Следовательно, удалите пузырьки воздуха с помощью шприца, чтобы убедиться, что во всех линиях отсутствует воздух. Начните перфузию раствором для децеллюляризации. Проведите перфузию раствором для децеллюляризации.

До тех пор, пока через легкие не будет проведено перфузия 500 миллилитров раствора, оптимальное давление должно составлять менее 15 миллиметров ртутного столба. Обычно это занимает 2,5 часа. Скорость потока вначале обычно очень низкая, а в течение второго часа она быстро увеличивается примерно до одного миллилитра в минуту или более.

В процессе перфузии периодически удаляйте отработанный раствор для децеллюляризации из биореактора, следя за тем, чтобы объем жидкости оставался достаточным для обеспечения работы легкого и трахеальной канюли. По завершении перфузии раствором для децеллюляризации перенесите легкие и биореактор в ламинарный шкаф для культивирования тканей. Для начала промывания органа замените банку объемом 500 мл с раствором для децеллюляризации стерильной банкой, содержащей до одного литра стерильного PBS.

Используйте вакуумный отсасыватель или шприц, чтобы убедиться в отсутствии воздуха в линиях; аналогичным образом проведите перфузию PBS через сосудистую систему под давлением от 10 до 15 мм ртутного столба. Как и при децеллюляризации, используя стерильные методы, периодически удаляйте отработанный PBS из биореактора и заменяйте или доливайте PBS в емкость. Продолжайте промывание свежим стерильным PBS до тех пор, пока через легкие не пройдет не менее 2,5 литров стерильного PBS.

Обычно этот процесс занимает два дня с момента начала децеллюляризации до завершения промывки. Перенесите легкие в новую стерильную систему биореактора, содержащую свежий PBS с добавлением 10% FBS и 10% Pen strep; убедитесь, что весь контур перфузии и все дыхательные пути заполнены жидкостью. Начиная с этого момента, для перфузии легких со скоростью 5 мм/мин будет использоваться пульсирующий насос.

Стерилизуйте скаффолд из внеклеточного матрикса легкого путем ночной перфузии PBS с добавлением 10% FBS и 10% пенициллина-стрептомицина. По завершении этого этапа поместите легкие в инкубатор при температуре 37 °C на один час или до достижения температурного равновесия. Следующим этапом подготовки к обработке Ben Nase является обработка легких Ben Nase.

Для удаления остаточной ДНК из каждого легкого сначала наполните один шприц объемом 10 milliliter только предварительно нагретым буфером Ben Nase, а другой шприц объемом 10 milliliter раствором Ben Nase в концентрации 90 units per milliliter, разведенным в буфере Ben Nase. Прекратите перфузию легких.

Затем раздуйте дыхательные пути буфером Ben Nase, стараясь не вводить воздух в легкое. Дайте легкому сдуться в течение одной минуты. После этого раздуйте легкое раствором Ben Nase.

Снова, стараясь не допустить попадания воздуха в легкое после раздувания с помощью Ben Nase. Оставьте легкие без перфузии и вентиляции при 37 °C на один час. По истечении одного часа возобновите перфузию раствором PBS с добавлением 10% FBS и 10% пенициллина-стрептомицина, который уже находится в биореакторе, и продолжайте перфузию в течение ночи до следующего дня.

После промывки и стерилизации длинный скаффолд из внеклеточного матрикса можно подготовить к заселению клетками. Замените раствор P-B-S-F-B-S benzo на 250 миллилитров культуральной среды. Проводите перфузию в течение как минимум одного часа до введения клеток, а непосредственно перед посевом клеток замените среду на свежую культуральную среду.

Для рецессии органов можно использовать многие источники клеток. В данном случае будет продемонстрировано заселение популяцией эпителиальных клеток. Сначала подготовьте шприц, содержащий 15 milliliters суспензии желаемой популяции эпителиальных клеток.

Затем заполните резервуар дыхательных путей 80 миллилитрами культуральной среды и убедитесь, что в вентиляционных линиях нет пузырьков воздуха. После этого поместите биореактор в инкубатор для культур тканей при температуре 37 °C и подключите шприцевой насос для вентиляции. Введите клетки в легкие одним быстрым болюсом, впрыснув 15 миллилитров клеточной суспензии в трахеальную канюлю.

Убедитесь, что воздушные фильтры основного биореактора закрыты колпачками. Затем немедленно начните один медленный цикл «вдоха», используя шприцевой насос для извлечения 60 milliliters воздуха из основного биореактора со скоростью 3 milliliters в минуту. Эта процедура займет приблизительно 20 минут.

После этого оставьте легкие в покое примерно на 18 часов. Начните медкую васкулярную перфузию со скоростью приблизительно 0,5 milliliters per minute. В процессе культивирования органов перфузию обычно проводят со скоростью от one до three milliliters per minute.

При использовании роликового насоса в процессе культивирования эпителия вентиляция обычно осуществляется с постоянной частотой один вдох в минуту и дыхательным объемом от 5 до 10 мл. При использовании шприцевого насоса воздух циклически извлекается из биореактора и нагнетается в него, что имитирует дыхание за счет чередования отрицательного и атмосферного давления внутри основной камеры. В связи с необходимостью поддерживать герметичность биореактора во время вентиляции, ее следует ежедневно приостанавливать для обновления воздуха в основной камере.

Кроме того, среду следует заменять примерно каждые три-четыре дня. В процессе культивирования легочного эпителия и сосудистого эндотелия при каждой замене следует обновлять примерно половину общего объема среды. С помощью скаффолда, установленного в биореакторе, мы можем создавать легочную ткань, способную осуществлять газообмен в течение коротких промежутков времени.

Здесь представлено стандартное окрашивание нативного легкого крысы гематоксилином и эозином для сравнения с окрашиванием децеллюляризированного легкого крысы по методу H&E. Конечный децеллюляризированный внеклеточный матрикс должен быть полностью очищен от клеточного материала и сохранять макроскопические, микроскопические и ультраструктурные характеристики нативного легкого. Окрашивание H&E позволит визуализировать любые остатки ДНК, прилипшие к каркасу в результате недостаточной децеллюляризации или промывки, что необходимо для создания оптимальных условий для посева клеток и последующего культивирования легкого.

Биореактор должен обеспечить равномерное распределение клеток во всех пяти долях легкого и покрытие примерно 70% каркаса внеклеточного матрикса. На этих изображениях представлено сравнение нативного легкого и репопулированного легкого, окрашенных методом иммунофлуоресценции. Что касается основных маркеров легкого, культивируемая популяция клеток проявляет позитивность по секреторному белку клеток Клары просекреторному белку C и аквапорину 5.

На всех панелях интересующие маркеры показаны красным цветом, а окрашенные DAPI ядра — синим. После освоения эта процедура, от децеллюляризации до восстановления, может быть выполнена за четыре-пять дней при правильном соблюдении протокола.