Измененный мышиных эмбриональных стволовых клеток основанных Пробирной для Количественная Кардиогенный эффективность индукционной

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении ключевой временной регуляции, необходимой для дифференцировки кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток мыши. Для этого на первом этапе формируются эмбриональные тельца в 96-луночном планшете с круглым дном для стандартизации процесса образования ЭТ. На втором этапе в ЭТ добавляют белковые или химические модуляторы в соответствии с заранее определенным графиком, что позволяет осуществлять временной контроль исследуемых путей.

Затем проводится ручной подсчет сокращающихся EBS для определения эффективности индукции при различных схемах модуляции сигналов. Полученные результаты, основанные на проценте сформированных сокращающихся EBS и подтвержденные методом «висячей капли», позволяют установить временные требования к основным сигнальным путям для дифференцировки кардиомиоцитов. Основным преимуществом данной методики перед существующими способами, такими как метод «висячих капель», является стандартизация и упрощение трудоемкой процедуры, а также обеспечение возможности прямого считывания данных для количественного анализа.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии стволовых клеток, такие как определение основных сигнальных путей коагуляции, которые направляют дифференцировку в сторону желаемого типа клеток. Для начала данной процедуры выращивают эмбриональные стволовые клетки мыши в 10-сантиметровых чашках для культивирования клеток в среде для ES-клеток мыши с добавлением лейкозного ингибирующего фактора. Когда ES-клетки достигают 50–70% конфлюэнтности, они готовы к использованию.

Удалите среду ES и один раз промойте клетки пятью миллилитрами стерильного PBS. Добавьте в каждую лунку два миллилитра 0.05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте планшеты при 37 °C в течение трех-пяти минут. Затем нейтрализуйте действие трипсина-ЭДТА, добавив в каждую лунку три миллилитра среды ES, и перенесите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Центрифугируйте при 1000 об/мин в течение трех минут. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток требуемым количеством среды EB. Подсчитайте количество клеток, затем разведите их до концентрации 5 × 10³ клеток на мл.

С помощью многоканального дозатора внесите по 100 µL среды EB, содержащей клетки, в каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета с круглым дном. Количество необходимых 96-луночных планшетов будет зависеть от числа условий и временных точек эксперимента. Поместите 96-луночные микротитрационные планшеты с круглым дном в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2 для определения критических временных интервалов ключевых сигнальных путей кардиогенеза.

К ЭС-клеткам добавляют модуляторы специфических сигнальных путей. В лунки 96-луночных планшетов с круглым дном в разные моменты времени добавляют сигнальный модулятор, разведенный в среде. Половина лунок в каждом 96-луночном планшете используется для каждой временной точки начала обработки.

В остальные 48 лунок для каждой временной точки добавляют контрольный раствор (растворитель). В различных временных точках остановки мы будем вымывать модуляторы сигнализации из каждой лунки путем замены среды; при этом следует соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить эмбриональные тельца. В установленные временные точки остановки вымойте модуляторы, заменив среду в лунках с EB. Наклоните 96-луночный планшет примерно на 10 градусов и осторожно удалите среду из лунки с помощью многоканального дозатора.

Затем, для любого режима культивирования продолжительностью более 48 часов, в каждую лунку добавьте среду EB без модулятора. Заменяйте среду EB с добавлением свежих модуляторов каждые два дня до достижения желаемого времени остановки. Через семь дней после индукции EB, осуществленной путем переноса ES-клеток в 96-луночные планшеты, исследуйте сокращение EB под микроскопом.

Определите лунки с сокращающимися EBS как положительные, чтобы рассчитать процент сокращающихся EBS для каждого временного курса обработки. Окна временной сигнализации для кардиогенеза, выявленные в экспериментах на 96-луночных планшетах, могут быть подтверждены на EBS, созданных методом висячих капель, для получения висячих капель ЭБ. Сначала подготовьте чашки Петри, добавив три-четыре миллилитра PBS для предотвращения последующего искажения формы капель.

Затем суспензию ЭСК, приготовленную в конечной плотности 2,5 × 10⁴ клеток/мл, переливают в чашку Петри для удобства работы. С помощью многоканального дозатора нанесите капли ЭСК объемом 20 µL на перевернутые крышки чашек Петри. Следите за тем, чтобы отдельные капли не соприкасались друг с другом.

Как правило, на одну крышку можно поместить до 80 капель. Затем накройте этим образом чашку Петри с PBS и инкубируйте в течение 48 часов в инкубаторе при температуре 37 °C и 5% carbon dioxide для формирования EB. Через 48 часов смойте образовавшиеся EB из висячих капель с каждой крышки, используя три миллилитра среды для EB.

Перенесите два крышки с EBS в новую чашку Петри. Инкубируйте чашку Петри в течение четырех дней в инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide. На четвертый день перенесите EBS во взвешенном состоянии на шестилуночные планшеты, покрытые 0.2% Gelatin. В каждую лунку переносят по 30 EBS. Инкубируйте с модуляторами сигнализации в течение периода времени, определенного в ходе экспериментов на 96-луночных планшетах, через семь дней после создания висячих капель.

Наблюдайте за ЭБ под микроскопом на предмет сокращений: ЭБ из ЭСК, выращенных в круглых лунках 96-луночного планшета, формируют ЭБ, как показано на данном репрезентативном изображении ЭБ, сформированного на четвертый день. Критическими временными точками кардиогенеза ЭСК являются временные интервалы, в которых наблюдается наибольший процент сокращающихся ЭБ при воздействии модуляторов сигнализации по сравнению с контролем (плацебо). Здесь показан спонтанно сокращающийся фокус кардиомиоцитов, образовавшийся из ЭСК, обработанных дорсальным морфином, на 10-й день дифференцировки на 96-луночном микротитрационном планшете.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как эффективно определять критическую временную регуляцию и временные окна ключевых сигнальных путей при кардиогенезе из ЭСК.