Высокая пропускная измерения и классификации органических P в пробах окружающей среды

Общая цель данной процедуры — классифицировать гидролизованный ферментами органический фосфор в экстрактах образцов почвы или навоза. Для этого сначала образцы экстрагируют раствором ЭДТА и гидроксида натрия с последующей корректировкой pH экстрактов. Затем эти скорректированные экстракты инкубируют с двумя различными растворами ферментов.

На планшете с 96 лунками заключительным этапом является измерение количества высвобожденного ферментом ортофосфата с помощью молибденово-синего колориметрического метода. В конечном итоге большинство природных форм моноэфирного и диэфирного фосфора ортофосфата в образцах почвы или навоза могут быть классифицированы на основе дифференциального высвобождения ортофосфата методом ферментативного гидролиза. Этот метод можно недорого реализовать в любой стандартной лаборатории.

Основное преимущество данного метода перед существующими, такими как ядерный магнитный резонанс на ядрах фосфора 31, заключается в возможности измерить потенциал нативных почвенных ферментов по высвобождению ортофосфатов из органических соединений гороха в будущем. Таким образом, данные, полученные этим методом, могут помочь в прогнозировании плодородия почвы или способности почвы высвобождать вредное количество доступного для водорослей ортофосфата. Добавьте 30 milliliters 0.25 molar раствора гидроксида натрия к двум граммам влажного или высушенного образца в конической пробирке объемом 50 milliliters.

Инкубируйте при перемешивании в течение 16 часов при комнатной температуре. Центрифугируйте образцы при 3000 ×g в течение 30 минут, затем перенесите 100 µL в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, в которой уже находится ацетатный буфер. Итоговый объем доведенного до нормы образца составляет 1 мл, pH равен 5,0.

Приготовьте два стоковых раствора, содержащих 0,5 ед/мл кислой фосфатазы, в 10 мл свежеприготовленного 0,1 M ацетата натрия с pH 5. Добавьте реконструированную лиофилизированную нуклеазу NP1 из Penicillium citron в одну из пробирок с 10 мл стока кислой фосфатазы до конечной концентрации 2,5 ед NP1/мл, аккуратно перемешав путем нескольких переворачиваний; центрифугируйте оба ферментных раствора при 3000 ×g в течение 30 минут. Для построения калибровочной кривой сначала добавьте 1 мл 1 мМ стокового раствора фосфата калия в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и выполните семь последовательных разведений по 0,5 мл; отбросьте первую пробирку так, чтобы конечный диапазон разведений составлял от 20 мкМ до 0,625 нМ фосфора.

Теперь перенесите стандарты ОРТОФОСФАТА в последние две колонки планшета, начиная с 0 nM ортофосфата в ряду A и заканчивая 20 nM ортофосфата в ряду H в первых трех лунках колонки 10. Добавьте 40 µL раствора ферментов PP и GP в следующие три лунки колонки 10. Добавьте 40 µL раствора одного фермента PP плюс GP плюс NP.

Наконец, добавьте по 40 µL 100 мМ ацетатного буфера во все шесть лунок. Теперь в каждой из первых шести лунок в колонке 10 должно находиться по 80 µL раствора. В следующие две лунки добавьте по 40 µL раствора ацетата натрия, содержащего 10 M глюкозы и шесть фосфатов, а также по 40 µL раствора ферментов PP и GP.

Для каждого исследуемого образца распределите по 40 µL экстрактов образцов с отрегулированным pH по лункам с первой по девятую в восьми рядах, предварительно распределив все образцы. С помощью многоканального дозатора внесите раствор ферментов PP и GP в колонки с первой по третью, раствор PP, GP и NP в колонки с четвертой по шестую и 0,1 M натрий-ацетатный буфер в колонки с седьмой по девятую. Выполните этот этап быстро, чтобы обеспечить всем образцам эквивалентное время инкубации.

Накройте 96-луночный планшет крышкой и инкубируйте образцы, растворы ферментов, контроли и калибровочную кривую ровно один час при 37 °C в деионизированной воде. Приготовьте по 50 мл четырех основных стоковых растворов. Раствор A должен готовиться ежедневно с помощью многоканального дозатора в режиме быстрого перемещения.

Добавьте 25 µL SDS, 100 µL раствора а, 20 µL раствора B и 50 µL раствора C во все лунки 96-луночного планшета. Накройте планшет крышкой и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. В завершение измерьте оптическую плотность при 850 nm на любом подходящем микропланшетном ридере с использованием приложения для работы с электронными таблицами.

Сначала постройте калибровочный график для неорганического фосфора, где по оси X отложены значения от 0 до 20 нмоль фосфора, а по оси Y — среднее значение дубликатов измерений абсорбции; проведите линейную регрессию и определите уравнение линии наилучшего соответствия. Затем рассчитайте фоновый уровень неорганического фосфора, вычислив среднее значение по колонкам с первой по третью, и примените калибровочный график к полученному набору данных. Далее, для определения количества фосфора, полученного в результате гидролиза моноэфиров фосфата, вычислите среднее значение трех повторностей образцов по колонкам с четвертой по шестую и вычтите из него значение контрольного раствора фермента и фонового уровня неорганического фосфора.

Затем для расчета содержания фосфора по количеству гидролизованного фосфора DER вычисляют среднее значение для трех повторностей образцов из столбцов с седьмого по девятый и вычитают из него сумму значений контрольного раствора фермента, фонового неорганического фосфора и гидролизованного моноэфира фосфора из столбцов с четвертого по шестой. На типичном 96-луночном планшете представлены результаты для восьми образцов и калибровочная кривая. Контроли расположены в 10-м столбце.

Увеличение интенсивности окраски между первым и третьим столбцами и между четвертым и шестым столбцами обусловлено гидролизованными моноэфирными соединениями фосфора; между четвертым и шестым и между седьмым и девятым столбцами — гидролизованными диэфирными соединениями фосфора. В данной работе метод высокопроизводительного ферментативного гидролиза был успешно использован для анализа распределения классов фосфора в вытяжках образца почвы из штата Вермонт, полученных с использованием 0,25 молярного раствора гидроксида натрия и 0,05 молярного раствора EDTA. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как измерять содержание природного ортофосфата, моноэфирных и диэфирных соединений фосфора в вытяжках из почвы или навоза с помощью ферментативного гидролиза.

Данный метод может помочь исследователям в области химии окружающей среды и управления питательными веществами изучить поведение органического P в почвах или системах внесения навоза.