Характеризуя Бактериальные Летучие использованием вторичного Электроспрей ионизации масс-спектрометрия (СЕСИ-MS)

Вторичная электрораспылительная ионизация с масс-спектрометрией (CS EMS) позволяет проводить анализ летучих бактериальных соединений без необходимости предварительной подготовки проб. Газообразная фаза над бактериальной культурой вытесняется диоксидом углерода в реакционную камеру CSSI. Проходя через реакционную камеру SSI, летучие вещества пересекают облако электрораспыления и ионизируются.

После ионизации летучие вещества поступают в масс-спектрометр для анализа. Избыток газа-носителя и нереактивные бактериальные летучие вещества проходят через фильтр с размером пор 0,22 micron для удаления любых бактериальных агентов в качестве дополнительной меры защиты и выводятся в вытяжной шкаф. В конечном счете, данный протокол CSI MS позволяет получить «отпечатки» летучих веществ бактерий в течение нескольких минут.

Мы полагаем, что эта технология может найти применение во многих областях, включая анализ выдыхаемого воздуха для диагностики инфекционных заболеваний или даже в пищевых системах, где мы могли бы оперативно обнаруживать патогены, находящиеся на продуктах питания или в них. Данный метод обладает несколькими основными преимуществами по сравнению с существующими методами, такими как GCMS, sift-MS и PT-RMS: во-первых, летучие соединения не требуют никакой предварительной обработки перед анализом.

Во-вторых, существует возможность фрагментировать определенные ионы в летучей смеси, что упрощает идентификацию соединений. И в-третьих, этот метод является экспрессным: обычно процедура занимает менее пяти минут.

Для анализа каждого образца выберите подходящий сосуд для выращивания культуры, учитывая требования данного вида к росту, а также необходимость эффективной доставки летучих веществ в масс-спектрометр. В данной демонстрации мы использовали стандартные стеклянные бутыли для сред объемом 100 milliliter. Летучие вещества бактерий доставляются в масс-спектрометр потоком газа-носителя для сборки системы.

Газовые линии подсоединяют к культуральным флаконам с резьбовыми крышками, имеющими не менее двух люерных портов. Вставьте линии подачи и отвода газа через люерные порты и заглушите все дополнительные порты перед культивированием образцов. Подайте давление в сосуды и погрузите их в воду для проверки на герметичность.

Утечки газа являются основной причиной получения нетипичных результатов в виде слабых или отсутствующих сигналов летучих ионов в течение ночи. Культуры E. coli K12 и Pseudomonas aerogenes PAO1 в среде LB Lennox; для каждого вида подготавливают по два биологических повтора.

Подготовьте девять стерильных культуральных флаконов, содержащих 50 milliliters LB Lennox, и один неинокулированный флакон для использования в качестве холостой пробы. Инокулируйте каждую ночную культуру в два флакона с образцом для создания технических повторностей. Инкубируйте культуры и холостую пробу в течение 24 часов при 37 degrees Celsius. Поскольку система CEMS специально разработана для анализа летучих соединений, ограничьте использование душистых средств личной гигиены перед работой с прибором.

Плотно закройте все емкости с летучими химическими веществами в лаборатории и максимально ограничьте сквозняки во время проведения испытаний, чтобы предотвратить загрязнение прибора и линий подачи газа. При работе с жизнеспособными биологическими агентами установите фильтры с соответствующим размером пор в линию газа-носителя. Фильтры не будут препятствовать переносу летучих веществ в реакционную камеру sesi, но могут незначительно повлиять на эффективность переноса аэрозоля.

Чтобы убедиться, что подача напряжения отключена и система разряжена, проверьте индикаторы выключения источника напряжения. Убедитесь, что показания мультиметра равны нулю, и заземлите электрические выводы. После этого залейте раствор для электрораспыления, предназначенный для анализа.

В режиме положительных ионов мы используем электрораспылительный раствор, состоящий из 0,1% formic acid, 5% methanol и 94,9% water. Для достижения оптимальной интенсивности и стабильности сигнала включите подачу газообразного углекислого газа в качестве газа-носителя и установите скорость потока 2 liters per minute. Подайте давление в резервуар для электрораспыления, чтобы начать подачу раствора в реакционную камеру со скоростью 5 nanoliters per second. Затем включите источник питания и установите напряжение 2.5 kilovolts.

Приложенное напряжение влияет на интенсивность сигнала ионов и стабильность конуса электрораспыления; для нашей системы оптимальные результаты в режиме положительных ионов достигаются при напряжении от 2 до 5 кВ. Соблюдайте осторожность, так как при этом металлические поверхности источника ионизации могут стать источником опасного удара током. Теперь настройте метод тюнинга для мониторинга масс-спектра.

Снимите флажок многоканального анализатора или MCA. Установите время сбора данных от 10 до 15 минут и запустите сбор данных. Проанализируйте спектры фона газа-носителя и произведите точную настройку приложенного напряжения для получения стабильной общей ионной хроматограммы и воспроизводимых сканов.

Продолжайте сбор спектров и A TIC в течение пяти минут, чтобы убедиться в стабилизации прибора. Введите параметры сбора данных, соответствующие вашему эксперименту. Запишите фоновый спектр газа-носителя для последующих экспериментов.

Для получения фонового спектра направьте поток газа-носителя через байпасные линии, затем при закрытых клапанах подсоедините холостую пробу к линиям переноса прибора. Откройте клапаны флакона с пробой и закройте клапаны байпасных линий.

Для получения воспроизводимых спектров дайте системе прийти в состояние равновесия в течение 30 секунд, пока стабилизируется влажность в реакционной камере. Чтобы убедиться в достижении равновесия, следите за TIC, который будет изменяться в период уравновешивания, после чего стабилизируется.

После достижения системой равновесного состояния начните сбор спектра. По завершении сбора спектра извлеките флакон с образцом, предварительно открыв линии байпаса газа-носителя, а затем закрыв клапаны подачи образца.

И, наконец, извлеките флакон с образцом. Продувайте систему газом-носителем от двух до четырех минут, чтобы удалить влагу и абсорбированные летучие вещества из линий переноса и предотвратить перенос компонентов от одного образца к другому. Соберите данные о летучих «отпечатках пальцев» для каждого бактериального образца, периодически регистрируя дополнительные спектры холостого опыта для обеспечения тщательного вычитания фона.

Летучие профили (отпечатки) в режиме положительных ионов для E. coli и P. aerogen, выращенных аэробно в среде LB Lennox в течение 24 часов при 37 °C, имеют отчетливые различия. В летучем спектре E. coli доминирует indu при отношении массы к заряду 118, тогда как спектр Pseudomonas aerogen содержит более разнообразные белково-аддуктные пики.

При выполнении данной процедуры важно фиксировать инструментальные параметры, которые вы оптимизировали для вашего анализа, такие как приложенное напряжение, состав раствора для электрораспыления и скорость потока газа-носителя. Также необходимо вести учет репрезентативных спектров, чтобы иметь возможность воспроизвести результаты анализов в будущем. Не забывайте, что работа с патогенными бактериями и высоким напряжением может быть крайне опасной.

Следовательно, следует всегда принимать такие меры предосторожности, как ограничение доступа к css CMS во время эксперимента. Теперь вы должны иметь возможность воспроизводимо получать спектры CSS и EMS для бактериальных летучих веществ в вашей системе. Желаем удачи.