Кремний Микрочипы для манипулирования межклеточных Взаимодействие

Здравствуйте, я Эллиот Ху. Я постдок в лаборатории Тии здесь, в Массачусетском технологическом институте. Сегодня мы подготовим клеточные культуры на кремниевых микромеханических чипах. Эти устройства выглядят как маленькие гребенки, которые сцепляются друг с другом, и они позволяют нам точно управлять взаимодействиями между двумя различными популяциями клеток.

Сегодня мы изучим взаимодействие между гепатоцитами печени и поддерживающими стромальными клетками. В частности, фибробласты линии 3T3 культивируются на верхней поверхности гребенчатых структур, что позволяет перемещать клетки и изменять их пространственное расположение путем сдвига зубцов гребенки. Каждое устройство разделено на две части, которые защелкиваются друг с другом в двух возможных конфигурациях.

В первом случае две популяции клеток приводятся в контакт друг с другом. Во втором случае две популяции слегка разделяются так, чтобы клетки не могли соприкасаться. В этом случае контактные взаимодействия предотвращаются, но взаимодействия через секретируемые факторы сохраняются.

Начнем с того, как правильно перемещать детали с помощью пинцетов. Я рекомендую использовать как большие тефлоновые пинцеты, так и металлические пинцеты с тонкими круглыми кончиками. С помощью больших пинцетов можно захватывать детали за края; при работе с более крупными деталями, имеющими «плечи», следует соблюдать осторожность, чтобы не сломать их, так как они очень хрупкие.

Таким образом, вам нужно захватить их с задней части детали. С помощью металлических пинцетов можно добраться до отверстия и извлечь чипы напрямую. Более крупные детали поместятся в лунку 12-луночного планшета, в то время как более мелкие подойдут либо для 24-луночного планшета, либо их можно разместить в паре с более крупной деталью.

Для работы с 12-луночным планшетом я обычно использую металлический пинцет. При соединении двух деталей в лунке я сначала помещаю более крупную деталь в лунку и прижимаю ее к одному из краев. Затем я беру соответствующую ремонтную деталь, помещаю ее с другой стороны лунки и соединяю их, используя два пинцета, вставляя по одному в каждое отверстие.

Теперь я могу просто зафиксировать детали вместе, либо в конфигурации с зазором, либо в конфигурации контакта. Если мне нужно разъединить детали, я предпочитаю перевести их в конфигурацию с зазором, а затем потянуть вертикально вверх, чтобы извлечь деталь. Поскольку устройства изготовлены из кремния, их необходимо покрыть специальным слоем для обеспечения надлежащей адгезии клеток.

Вероятно, вы получите устройства, которые уже покрыты полистиролом и подвергнуты воздействию плазмы, поэтому мы будем считать это отправной точкой. Прежде всего, мы будем использовать коллаген для покрытия поверхности, к которой будут прикрепляться гепатоциты. Поместите гребенки для гепатоцитов в раствор коллагена с концентрацией 50 µg/mL и инкубируйте при 37 °C в течение 45 минут.

С гребнями для фибробластов, с другой стороны, покрытие не требуется. После инкубации мы аспирируем раствор коллагена, промываем и промываем водой. Теперь мы закрепим ES вместе в контакте с соответствующими частями, чтобы создать плоскую поверхность для посева клеток.

Сначала мы заполним несколько лунок 70% этанолом. Я помещу по паре образцов в каждую лунку, а затем зафиксирую их вместе. После фиксации необходимо осмотреть детали под микроскопом, чтобы убедиться в их копланарности.

Время от времени детали могут заблокироваться с перекосом. В этом случае под микроскопом будет видно, что они находятся в разных фокальных плоскостях. Тогда просто разделите детали и снова соедините их. Убедившись, что выравнивание выполнено правильно, оставьте детали в этаноле на некоторое время для стерилизации.

Часто, чтобы сэкономить время, я ограничиваюсь замачиванием на 10 минут. После стерилизации необходимо промыть образец. Тщательно аспирируйте этанол и промойте водой, затем снова аспирируйте и промойте водой, и, наконец, удалите воду путем аспирации и замените ее вашей культуральной средой.

Теперь перейдем к посеву клеток на устройства. Обычно мы суспендируем клетки в концентрации 500, 000 клеток на мл и с помощью 12-луночного планшета переносим по 1 мл суспензии на каждую пару гребенчатых структур. Таким образом, мы посеяли фибробласты в концентрации 500, 000 клеток на мл в две из лунок.

Аналогичным образом мы взяли суспензию из 500 000 гепатоцитов на лунку и посеяли их в две другие лунки. Теперь, перед инкубацией, нам необходимо тщательно встряхнуть клетки, чтобы обеспечить их равномерное распределение. Я рекомендую встряхнуть планшет три раза по вертикали, три раза по горизонтали, а затем повторить эту процедуру трижды.

После перемешивания мы поместим образец в инкубатор и оставим клетки на 15 минут, после чего снова их перемешаем. Повторяя перемешивание каждые 15 минут в течение одного часа, мы затем аспирируем суспензию клеток и наносим новую суспензию. Мы будем повторять эту процедуру до тех пор, пока не образуется конфлюэнтный слой клеток.

Обычно для фибробластов требуется один или два посева, а для гепатоцитов может потребоваться от двух до четырех посевов. Чтобы получить сплошной монослой, клетки высевают с достаточно высокой плотностью; встряхивание обеспечивает их равномерное распределение.

После первого посева образуется редкий слой клеток. Обратите внимание, что клетки прикрепляются только к тем пальцам, которые были покрыты полистиролом и коллагеном. После посева свежих клеток и инкубации в течение еще одного часа, также с встряхиванием каждые 15 минут, слой клеток становится более плотным.

После третьего пассирования достигается достаточная плотность клеток, и теперь можно прекратить процесс после того, как клетки были высеяны на гребни. Далее следует распределить клетки в соответствии с требуемой экспериментальной конфигурацией. Теперь устройства отделяют от их дополнительных частей и инкубируют в течение 24 часов.

Через 24 часа клетки распластываются, образуя сплошной монослой на поверхности гребней. Теперь необходимо создать совместную культуру. Гребень с гепатоцитами и гребень с фибробластами переносят в одну и ту же лунку и фиксируют друг с другом в требуемой исходной конфигурации.

При желании через определенный промежуток времени конфигурацию можно изменить. Например, через 18 часов можно перейти к конфигурации с зазором: детали помещают в то же устройство, плотно прижимая их друг к другу до достижения конфигурации с зазором, после чего снова приводят в контакт, возвращаясь к конфигурации с зазором.

Теперь мы извлечем один гребень. Далее мы пройдем через процесс удаления старого полистирольного покрытия, очистки чипов, а затем нанесения нового полистирольного слоя и подготовки к культивированию клеток. Повторно удаляя старое полистирольное покрытие и нанося свежий слой, мы гарантируем, что остатки предыдущего эксперимента не повлияют на новый эксперимент.

После завершения эксперимента первым делом необходимо промыть ваши чипы раствором гипохлорита натрия, а затем промыть гребенки водой. Перед тем как поместить чипы в тюбинг, убедитесь, что они полностью высохли. Здесь у нас есть несколько гребенок, которые я оставил высыхать на воздухе; проверьте, что они полностью высохли.

Теперь мы возьмем небольшое количество тугомелкого вещества и перенесем его в этот стеклянный стакан. Для этого воспользуемся стеклянной пипеткой, чтобы избежать растворения материала. Поскольку данное вещество растворяет пластик, использовать обычные полистирольные пипетки нельзя.

Хорошо, этого достаточно. Теперь мы возьмем несколько таких деталей, поместим их в толуол, включим шейкер для перемешивания и накроем алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить испарение толуола. Спустя два часа толуол должен растворить большую часть полистирола на гребенках, после чего их можно будет извлечь и высушить на воздухе.

После промывки в растворе «Halloween» детали должны быть относительно очищены от полистирола и в целом чистыми. Однако нам необходимо добиться абсолютной чистоты деталей, так как в противном случае новый слой полистирола может иметь плохую адгезию. При недостаточной чистоте полистирол имеет тенденцию отслаиваться в середине эксперимента, когда клетки начинают воздействовать на него.

Теперь мы проведем очистку раствором «пиранья». Я поместил детали в стекковый стакан, и теперь мы будем их нагревать, используя нагревательную плитку.

Здесь у нас есть серная кислота и перекись водорода. Сначала я налью серную кислоту; при этом необходимо убедиться, что все чипы полностью погружены в жидкость. Иногда они имеют тенденцию всплывать.

Также, поскольку мы работаем с довольно агрессивными химическими веществами, убедитесь, что на вас надеты соответствующие средства защиты. На мне сейчас нитриловые перчатки. Теперь мы будем вливать пероксид водорода в кислоту; будьте осторожны, так как это экзотермическая реакция.

Как видите, в процессе реакции наблюдается небольшое задымление, однако для повышения реакционной способности нам необходимо добавить энергии в систему. Поэтому сейчас мы нагреем ее до 120 °C; при температуре около 120 °C можно быть уверенным, что все остатки клеточной культуры будут полностью удалены с чипов. На данном этапе следует дать реакции пройти полный цикл до полного расхода перекиси водорода.

В этот момент смесь перестанет пузыриться. Таким образом, реакция занимает около получаса. Когда пузырьки исчезнут, можно выключить плитку и дать смеси остыть.

Затем мы перенесем их в воду с добавлением BAK. Еще раз убедитесь, что вы используете тефлоновый пинцет, а не металлический; просто захватите образцы и перенесите их. Теперь мы промоем их под непрерывным потоком DDH₂O. Обычно я беру воду прямо из основного трубопровода и оставляю поток включенным минимум на 10 минут.

Таким образом, после измельчения мы промоем образцы под проточной водой в течение 10 минут, чтобы удалить все следы кислоты. Кислота должна быть полностью удалена из чипсов, после чего мы будем хранить их в воде до тех пор, пока не будем готовы к нанесению полистирола. Мы используем полистирол с молекулярной массой 45 000, полученный от Sigma. Сейчас мы отвесим небольшое его количество.

У нас есть 400 мг вещества, которое мы растворим в толуоле из расчета 100 мг/мл. Работа с толуолом должна проводиться в вытяжном шкафу. Также, поскольку для растворения полистирола используется толуол, необходимо убедиться, что в процессе не используется лабораторная посуда или оборудование из полистирола.

Для этого мы используем коническую полипропиленовую пробирку и стеклянную пипетку. Поскольку у меня есть 400 mg полистирола, я добавлю 4 mL толуола. Теперь мы будем перемешивать смесь на вортексе в течение получаса до полного растворения полистирола. Мы будем перемешивать пробирку на вортексе на минимальной скорости примерно от 20 минут до получаса.

Теперь я закреплю пробирку в вортексе. Мне не нужно удерживать её там всё время. Через 20–30 минут полистирол должен раствориться, и мы сможем приступить к нанесению покрытия.

Теперь мы перейдем к нанесению полистирола методом центрифугирования в нашем центре. Наша установка для центрифугирования находится в чистом помещении. Поэтому здесь мы должны использовать шапочку, защитные очки, халат, бахилы и перчатки, но требования в вашем учреждении могут отличаться.

Перед использованием этого зажимного патрона я хочу защитить его от полистирола. Поэтому мы обернем его алюминиевой фольгой, стараясь максимально плотно прижать ее к поверхности, чтобы чип прилегал к ней вплотную. В центре мы проделаем небольшое отверстие, чтобы обеспечить вакуумный захват чипа.

Центрифуга установлена на 2 400 RPM и 30 секунд. Теперь возьмем один из чипов, расположим его так, чтобы центр чипа перекрывал отверстие; при помещении полистирола вакуум изначально будет выключен, затем я включу вакуум и запущу центрифугирование. Для более мелких деталей можно добавить чуть менее 10 капель.

Для более крупных частей потребуется чуть более 10 капель полистирола. Затем мы центрифугируем пробу в течение 30 секунд при 2 400 RPM. Теперь мы возьмем чипы с полистирольным покрытием и поместим их в печь при 120 °C. Эта температура выше точки стеклования полистирола.

Таким образом, поверхность расплавится, что позволит немного ее разгладить, а также увеличится плотность и твердость пластика. Поэтому обычно я оставляю изделие в печи на ночь. Для завершения этого процесса, вероятно, требуется как минимум несколько часов.

Таким образом, после запекания в течение ночи чипы готовы к плазменной обработке. Теперь мы подвергнем полистирол воздействию кислородной плазмы, что изменит поверхностную энергию, чтобы белки и клетки лучше прикреплялись к поверхности. Мы просто поместим чипы в плазменную камеру и откачаем воздух до создания вакуума.

Рекомендуемые настройки: давление 200 mTorr, вакуумирование и мощность 200 Вт в течение одной минуты при подаче кислорода. Теперь, когда система откачана, мы введем кислород. Теперь можно включить ВЧ-питание и создать плазму на одну минуту.

Когда плазма активна, она фактически светится, подобно люминесцентной лампе. После одной минуты воздействия плазмы мы вернем давление до атмосферного, и тогда детали можно будет извлечь.

Теперь детали готовы к покрытию белком и заселению клетками. Целью при разработке этого устройства была возможность динамического манипулирования микроархитектурой ткани. Таким образом, микроорганизация ткани в организме, а именно взаимное расположение клеток, играет очень важную роль в определении функции каждой отдельной клетки в лабораторной культуре.

До недавнего времени нам не удавалось добиться качественного воспроизведения этого процесса, но за последние пять-десять лет появилась возможность осуществлять микропаттернирование клеток на подложке для культивирования тканей, тем самым размещая клетки точно в тех местах планшета для культивирования, где они нам необходимы. Это позволило выявить некоторые важные аспекты фундаментальной биологии межклеточных взаимодействий на микроуровне. Однако до настоящего момента нам не удавалось реализовать этот процесс динамически.

Это означает изменение организации клеточной культуры в середине вашего эксперимента. Это важно, поскольку в организме ткани не являются статичной средой. У нас есть клетки, которые перемещаются и реорганизуются, что особенно характерно для процессов заживления ран или развития.

Но даже в обычном органе в состоянии гомеостаза происходит множество процессов. Самым сложным техническим аспектом обучения является то, как физически манипулировать частями. Вначале, когда вы только начинаете работать с системой, вас может напугать то, насколько хрупкими являются детали или насколько малыми должны быть ваши движения.

Но я полагаю, что если вы немного попрактикуетесь в его использовании, то не возникнет особых трудностей. Это устройство может быть полезно, например, при изучении эмбрионального развития, когда клетки при прохождении через различные эмбриональные слои вступают в контакт с последовательностью различных клеточных микроокружений. Известно, что взаимодействия с каждым из этих слоев при их последовательном контакте способствуют дальнейшему продвижению клеток по определенному пути дифференцировки.

Таким образом, мы полагаем, что устройство такого типа может быть полезным для попыток воспроизвести подобные события в лабораторных условиях. Одним из аспектов микроорганизации, который мы особенно хотели изучить, было различие между взаимодействием клеток посредством контактных взаимодействий, при которых клеточные мембраны могут соприкасаться друг с другом, и воздействием растворимых факторов, которые секретируются в окружающую среду и диффундируют к более удаленной клетке. Зачастую, когда клетки находятся в совместной культуре и влияют друг на друга, оставалось неясным, играют ли в этом процессе роль контактные взаимодействия или секретируемые факторы.