Β-глюкуронидазы (GUS) Основываясь Анализ гибели клеток

Общая цель данной процедуры заключается в использовании репортерной системы Gus для анализа потенциальных свойств, связанных с гибелью клеток, специфических генов. Интересующие гены клонируют в кассету Gus и экспрессируют в соответствующих векторах agrobacterium под управлением 35 s промотора. Затем эти векторы трансформируют в штамм Agrobacterium LBA 44 0 4 и смешивают с культурой, содержащей экспрессионную кассету Gus, для инокуляции листьев Nick Oceana Hamana.

Активность Gus можно оценить визуально с помощью гистохимического окрашивания или количественно с помощью флуориметрического анализа. Главное преимущество этого метода перед существующими способами, такими как анализ лестницы ДНК или TUNEL-анализ, которые часто применяются в системах млекопитающих, но трудно воспроизводимы на растениях, заключается в том, что это чувствительный и быстрый транзиентный анализ на растительных системах, основанный на том простом факте, что для экспрессии gas требуются живые клетки. Демонстрацию процедуры сегодня проведет Hua RAOs.

Для проведения инфильтрации постдокуранту-исследователю нашей лаборатории потребуются полностью развернутые здоровые листья растений nicotiana hamana в возрасте от трех до шести недель, выращенных при температуре 25 °C. Рассчитывайте на выполнение данного протокола в течение восьми дней. В первый день высейте на чашки штрихами глицериновые стоки agrobacterium tumor fassan, содержащие векторы для анализа гибели клеток и вектор с экспрессионной кассетой Gus; также всегда включайте пустой вектор в качестве отрицательного контроля или «заглушки» при тестировании нескольких комбинаций культур.

Инкубируйте чашки при 28 °C в течение двух дней. На третий день инокулируйте 2 mL селективной среды LB одной колонией с каждой чашки. Инкубируйте каждую культуру при перемешивании при 28 °C в течение 24 часов при 200 RPM до достижения максимальной плотности роста.

После 24 часов инкубации полностью ресуспендируйте культуру путем пипетирования (при наличии комков) и увеличьте общий объем каждой культуры до 10 milliliters свежей селективной средой LB для индукции генов вирулентности agrobacterium. Добавьте ацетон до концентрации 25 micromolar и инкубируйте каждую культуру при перемешивании при температуре 28 degrees Celsius еще в течение 16 часов. Следующим шагом является центрифугирование каждой культуры при 4, 000 Gs в течение 10 минут при комнатной температуре и ресуспендирование осадка в 10 milliliters среды для инфильтрации.

Не добавляйте ацетон, повторно центрифугируйте культуры, а затем ресуспендируйте. Пересуспендируйте каждый осадок в пяти миллилитрах среды для инфильтрации, содержащей 100 micromolar ацетона. Теперь измерьте OD при 600 nanometers.

Допустимы концентрации вплоть до 0.1, но если значение превышает 0.9, перед инфильтрацией разведите образец до 0.9 с помощью инфильтрационной среды и ацетона. После инкубации повторно инкубируйте культуры при 28 °C в течение трех часов с перемешиванием. Смешайте экспериментальные и контрольные культуры в соотношении один к одному с культурой, содержащей кассету Gus.

Для каждой культуры используйте одномиллилитровый шприц без иглы для инфильтрации через слой ABA или нижнюю сторону только что появившихся листьев. Объем инфильтрации не имеет существенного значения. Когда сформируется область, пропитанная водой, это будет означать, что добавлено достаточное количество раствора; инфильтрируйте отрицательный контроль и исследуемый ген на противоположных листьях одного и того же растения, затем аналогичным образом проведите инфильтрацию еще двух растений.

Таким образом, для каждой культуры используются растения в трехкратной повторности. Через три дня после инфильтрации наступает время сбора листьев и анализа экспрессии белка густина. Начните гистохимический анализ с вакуумной инфильтрации всего листа субстратом xlu до полного его пропитывания.

Теперь инкубируйте листья в темноте при комнатной температуре в течение ночи или до появления отчетливого синего окрашивания. Промойте листья дистиллированной водой и инкубируйте их в 70% ethanol в течение ночи до полного удаления хлорофилла. На следующий день промойте листья дистиллированной водой и оцените уровни экспрессии GUS.

Для количественного определения экспрессии Gus субстрат mug превращается в флуоресцентный продукт mu, который можно измерить; начните с растирания инфильтрированных дисков листьев в ступке с использованием жидкого азота. Затем добавьте 100 µL буфера для экстракции GUS, поддерживая образец на льду. Теперь центрифугируйте суспензию при 14,000 ×g в течение пяти минут при 4 °C и соберите супернатант, содержащий общие растворимые белки, включая Gus.

Измерьте общую концентрацию растворимого белка с помощью NanoDrop и доведите концентрацию до 100 µg общего белка для каждого образца в экстракционном буфере Gus. Затем добавьте субстрат mug в экстракционном буфере Gus в каждый образец до конечной концентрации 2 mM mug. Общего объема 100 µL на образец должно быть достаточно; перемешайте содержимое путем пипетирования и инкубируйте реакционную смесь в течение одного часа при 37 °C.

Через час остановите реакцию, добавив 800 µL стоп-буфера для GUS. Для количественного определения GUS 100 µL каждого образца наносят в микротитрационный планшет, который анализируют на флуоресцентном планшетном ридере; измеряют длину волны возбуждения 365 nm и длину волны эмиссии 455 nm, затем сравнивают результаты со стандартной кривой. Активность GUS может быть выражена как количество единиц GUS на µg общего растворимого белка в минуту реакции. Различные уровни активности GUS обнаруживаются в зависимости от используемой конструкции, когда кассета экспрессии GUS совместно инфильтрируется с негативным регулятором клеточной смерти или антиапоптотическим геном.

При сравнении наблюдаются высокие уровни Gus. Уровни Gus в контроле с пустым вектором значительно ниже. И наоборот, при использовании позитивного регулятора гибели клеток или проапоптотического гена наблюдается заметное снижение экспрессии Gus по сравнению с контролем с пустым вектором.

После освоения выполнение данного метода занимает приблизительно одну неделю. При проведении этой процедуры важно помнить, что данный метод используется в качестве начального этапа для определения потенциала специфических генов. Для подтверждения этих предварительных результатов и определения типа вовлеченных клеток требуются дополнительные исследования.