Живая изображения клеточных Экструзия из эпидермиса развивающихся данио рерио

Поддержание целостности эпителиальных тканей требует непрерывного удаления поврежденных и погибающих клеток без нарушения барьерной функции. Для достижения этой цели эпителий выталкивает погибающие клетки путем формирования и сокращения кольца из актина и миозина в клетках, окружающих погибающую клетку, чтобы извергнуть её, одновременно закрывая любые зазоры, которые могли возникнуть в результате её удаления. В данной видеостатье представлен метод индукции и визуализации экструзии апоптотических клеток из эпидермиса личинок zebrafish в режиме реального времени.

Как показано, это достигается путем инъекции зонда F-актина, меченого красным флуоресцентным белком, в эмбрионы трансгенных данио-рерио на стадии одной клетки, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок в эпидермисе, для визуализации актиновых филаментов в эпителиальных тканях. Личинки на четвертый день после оплодотворения, экспрессирующие как GFP, так и RFP, затем обрабатывают G418 для индуцирования апоптоза в эпидермисе. Динамика актина и изменения формы эпителиальных клеток, происходящие во время экструзии, визуализируются с помощью таймлапс-съемки на конфокальном микроскопе с вращающимся диском.

Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как иммунофлуоресцентный анализ, является возможность наблюдать за быстрыми изменениями и динамикой актина, которые происходят в процессе экструзии в живой эпителиальной ткани. В этом видео мы продемонстрируем процедуру визуализации экструзии апоптотических клеток из эпидермиса развивающейся зебрафиш в режиме реального времени. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории, чтобы понять, как клетки скоординированно перестраивают свой актиновый цитоскелет для удаления апоптотических клеток при сохранении барьерной функции, а также как нарушения процесса экструзии могут приводить к определенным патологическим состояниям.

Приступим к работе. Для визуализации динамики актина во время экструзии клеток в эпидермисе развивающейся зебрафиш начните с размораживания ранее транскрибированной РНК на льду. Мы транскрибируем мРНК, кодирующую красный флуоресцентный белок, слитый с гомологическим доменом кальпонина утрофина и актин-связывающим белком. Добавьте феноловый красный к РНК в соотношении один к одному до конечной концентрации РНК около 30 ng/µL и загрузите 1 µL раствора в капиллярную иглу методом обратного заполнения.

Соберите около 75 эмбрионов C-K-G-F-P на стадии 1 клетки в буфере E three. Перенесите собранные эмбрионы в форму для микроинъекций с помощью пастерной пипетки объемом 5,75 мл и аккуратно расположите эмбрионы в желобке, используя пинцет Dumont №5. Работайте быстро, чтобы избежать введения РНК в эмбрионы на разных стадиях развития, используя стандартный лабораторный диссекционный стереомикроскоп.

С помощью микроинъектора с контролем давления введите РНК в желток эмбрионов, используя фенол в качестве индикатора. После инъекции в эмбрионе должен стать виден красный цвет. Убедитесь, что для каждого эксперимента введено вещество как минимум в 50 эмбрионов.

Отсортируйте эмбрионы, чтобы удалить все неоплодотворенные или поврежденные яйца, и инкубируйте все оставшиеся эмбрионы при 28 °C. Через 24 часа с помощью флуоресцентного диссекционного микроскопа отберите эмбрионы данио-рерио, имеющие высокий уровень флуоресценции GFP в эпидермисе и флуоресценцию с меткой RFP. Инкубируйте отобранные эмбрионы при 28 °C до начала обработки препаратом для индукции апоптоза путем воздействия аминогликозидом.

Антибиотик G 418 или лекарственное средство вызывает экструзию апоптотических клеток из эпидермиса развивающихся личинок zebrafish. Важно отметить, что данный метод вызывает экструзию клеток только у личинок в возрасте четырех дней после оплодотворения и старше. Соберите до 25 личинок zebrafish в возрасте 4 дней после оплодотворения, экспрессирующих GFP и RFP, в чашку для культивирования размером 35x10 мм, содержащую 3 мл среды E3.

Осторожно замените среду на три миллилитра E three, содержащей one milligram per milliliter of G four 18, и инкубируйте личинок в растворе препарата в течение четырех часов в темноте при 28 °C. Затем удалите среду и замените ее предварительно нагретой средой E three, содержащей 0.02% trica, и приступайте к закреплению личинок для визуализации. Перенесите до трех личинок в пробирку типа «фендор» объемом 1.5 мл и удалите большую часть среды E three.

Используя обрезанный наконечник дозатора, перенесите 120 µL 1% низкоплавящего агарозы в пробирку и перемешайте. Затем аккуратно перенесите личинок вместе со смесью агарозы на покровное стекло, расположенное на дне чашки для культивирования Matech. Используя держатель FST с вставным штифтом или вольфрамовой иглой, быстро сориентируйте личинок так, чтобы они лежали прямо и плотно прилегали к покровному стеклу.

Дайте агарозе затвердеть. Затем осторожно заполните чашку средой E3, содержащей 0,02% трикаина. Мы установили, что весь процесс экструзии апоптотических клеток из эпидермиса развивающихся личинок zebrafish занимает примерно 20 минут.

В данном видео мы демонстрируем, как организовать эксперимент по таймлапс-визуализации с использованием конфокального микроскопа с вращающимся диском и программного обеспечения and or IQ для сбора серии Z-стеков через один слой эпидермиса рыбки-зебра. Сначала с помощью ПО and or IQ включите аргоновый и гелий-неоновый лазеры, камеру микроскопа и эпифлуоресцентную лампу. Создайте протокол временных серий, содержащий длины волн для визуализации.

Частота интервалов между захватами изображений и количество повторений захвата. Осторожно поместите чашку Mattec с образцом на предметный столик микроскопа, затем с помощью объектива с 20-кратным увеличением и проходящего света сфокусируйтесь на личинках. Переведите объектив с 40-кратным увеличением для иммерсии в воду в нужное положение. Используя этот объектив, мы можем снимать примерно от 20 до 25 клеток в поле зрения, что позволяет отслеживать поведение клеток во время экструзии, одновременно разрешая субклеточную динамику актина.

Осторожно нанесите каплю воды на верхнюю часть объектива с 40-кратным увеличением и быстро установите сверху чашку Mattec. Найдите образец, используя освещение в светлом поле, затем используйте эпифлуоресценцию с длиной волны 488 nanometer, чтобы сфокусироваться непосредственно на GFP-положительном эпидермисе. Переключитесь в режим конфокального сканирования.

Соответственно настройте интенсивность лазера и время экспозиции для каждого из каналов. Постарайтесь сбалансировать мощность лазера и время экспозиции для оптимального детектирования сигнала и предотвращения фототоксичности. Чтобы определить экструдирующие клетки, используйте эпифлуоресцентную микроскопию для визуализации эпидермиса, меченного GFP, и найдите группу клеток в виде классической розетки, представляющую собой совокупность клеток, окружающих небольшую круглую клетку в центре.

Кроме того, должно быть заметно накопление меченого RFP актина в виде кольца вокруг небольшой округлой клетки в центре, что является характерным признаком экструзии клеток. После идентификации экструдируемой клетки быстро установите верхний и нижний пределы Z-серии и размер шага. Затем начните сбор четырех наборов данных конфокальной микроскопии в 4D для анализа данных и визуализации сокращения актинового кольца, а также эпителиальных процессов, происходящих вокруг погибающей клетки.

Со временем создайте 3D-проекции Z-серии и сохраните данные в виде видеофайла. Этот этап можно выполнить с помощью различных программных пакетов. На данном рисунке показана экспрессия RFP UTR CH в эпидермисе личинок zebrafish CK GFP на четвертый день после оплодотворения.

Здесь представлены Z-проекции отдельных кадров из таймлапс-видео, демонстрирующие динамику живых клеток. В процессе экструзии эпителиальных клеток стрелками показано кольцо актина, сформированное соседними клетками, которое сокращается и смыкается в течение двух минут. После этой процедуры можно использовать другие методы в сочетании с данной техникой, например, применение химических ингибиторов или генетических мутаций, чтобы лучше понять, как нарушение экструзии может приводить к определенным патологическим состояниям.

Исходя из проблемы с клиренсом апоптотических клеток, мы только что продемонстрировали вам, как организовать эксперимент по таймлапс-визуализации для наблюдения за процессом экструзии из эпидермиса развивающейся данио-рерио. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости ограничить количество света, воздействующего на образец, чтобы предотвратить фотообесцвечивание или токсичность. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.