Характеристика Изолированные, вентилируемый и легких мыши Instrumented озарен пульсирующего потока

Для изучения зависимости между пульсирующим легочным давлением и потоком. В данном протоколе описывается способ изоляции, вентиляции и перфузии легких мыши. Для проведения вентиляции трахея обнажается хирургическим путем.

Затем сердце и легкие изолируют, чтобы обеспечить возможность канюляции легочной артерии и левого предсердия. После этого проводят перфузию легочной системы. Эксперименты выполняют путем изменения потока в легочной артерии, его величины, формы волны и/или частоты.

Полученные формы волны давления в легочной артерии и левом предсердии регистрируются и демонстрируют пульсирующие зависимости давления и потока в легочном кровотоке. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как препараты in vivo, является то, что изменения в зависимостях давления и потока. Пульсирующие зависимости давления и потока могут быть получены в отсутствие изменений объема циркулирующей крови, тонуса симпатической нервной системы, активности и эффектов анестезии.

Кроме того, большинство изолированных препаратов легких позволяют измерять только стационарные зависимости между давлением и потоком, в то время как наш метод позволяет определять пульсирующие зависимости давления и потока. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии легких, например, как сосудистые заболевания легких влияют на пульсирующую гемодинамику легочного кровотока или как повышение жесткости крупных легочных артерий влияет на постнагрузку правого желудочка? Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как доступ к сердцу и легким, а также фиксация канюли в легочной артерии являются сложными навыками для освоения.

Избыточное давление, создаваемое оборудованием, может вызвать отек легких, а неправильное размещение канюли может привести к перфорации легочной артерии. Перед началом эксперимента необходимо подготовить систему IL one, используемую для вентиляции и перфузии изолированного легкого. Трубки должны быть подключены к датчикам давления.

Используя один насос и расходомер, полностью промойте систему дистиллированной водой, нагретой до 37 °C, и удалите все пузырьки воздуха из трубок. Затем заполните трубки насоса Endur tech 1% PBS. После этого установите нулевое значение.

Измерьте давление для каждого датчика P 75, сначала закрыв его клапан, ведущий к системе IL 1, и открыв клапан, ведущий в атмосферу. Затем используйте усилитель SIS с пробкой для автоматического обнуления давления. Перед подготовкой животного увлажните установку IO 1, погрузив керамический пористый элемент в дистиллированную воду. После анестезии мыши зафиксируйте ее для проведения операции, прикрепив передние лапы к пробковой доске.

Теперь обработайте область груди распылением 95%alcohol. Используя прямые пинцеты, захватите кожу в области шеи и сделайте разрез длиной один сантиметр прямыми ножницами. После обнажения внутренних структур шеи удалите белую железистую ткань в поверхностных мышцах, чтобы найти пищевод и трахею.

Изолируйте пищевод и трахею от окружающих тканей с обеих сторон и сзади, затем наложите свободную лигатуру вокруг трахеи. Для канюляции трахеи осторожно сделайте небольшим ножницами небольшой V-образный надрез с одной стороны. Теперь переместите мышь в систему IL one, используя тупые пинцеты.

Возьмите трахеальную канюлю и введите ее в трахею. Зафиксируйте канюлю швом. Начните вентиляцию сначала комнатным воздухом, обработайте грудную клетку спиртом и удалите кожу с помощью прямых пинцетов и прямых ножниц.

Разрежьте кожу вверх вдоль грудины. Приподнимите кожу с каждой стороны и сделайте надрезы вдоль линии нижних ребер. Затем захватите мечевидный отросток пинцетом и с помощью ножниц с тупым концом прорежьте отверстие в диафрагме в месте ее прикрепления к нижней части грудины.

Захватите диафрагму и отсеките ее от ребер. С помощью ножниц с тупыми концами снова захватите мечевидный отросток и осторожно разрежьте грудину через ребра, не повреждая легкие, сердце или кровеносные сосуды. Чтобы обнажить сердце, захватите левые ребра и отсеките их концы.

Теперь медленно введите в правый желудочек 0.1 milliliters гепарина. После инъекции удалите оставшиеся ребра. Используя тыльную или закругленную сторону пинцета, осторожно отодвигайте легкие от ребер, отрезая их под микроскопом. Удалите железистую ткань в жировой прослойке на поверхности сердца.

С помощью пинцета отодвиньте ткани и удалите их. Чтобы наложить шов вокруг аорты и легочной артерии с помощью пружинных ножниц, осторожно приподнимите сердце тупоконечным пинцетом. Сопротивление должно быть минимальным.

Теперь завяжите свободный шов с помощью двойного узла. Затем удалите нижнюю часть брюшной полости. Используйте угловые ножницы, чтобы рассечь ребра и позвоночник.

Это вызовет значительный кровоток. Используйте ватную палочку, чтобы остановить кровотечение. После остановки кровотока заполните систему IL четырьмя миллилитрами RPMI из шприца, заполненного 10 миллилитрами RPMI.

Рекомендуется повторно убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в трубке. Теперь проведите канюляцию правого желудочка, сделав небольшой надрез рядом с верхушкой и введя канюлю. Направляйте ее вниз по правому желудочку, чтобы достичь легочной артерии. Кончик зонда должен быть виден сквозь почти прозрачную стенку легочной артерии.

Затем затяните шов вокруг канюли, аорты и легочной артерии, чтобы канюлировать левый желудочек. Сделайте небольшую надрез в области верхушки и введите канюлю, направляя ее вверх в сторону левого предсердия. Может потребоваться легкое нажатие, чтобы найти клапан, но как только он будет найден, канюля пройдет сквозь него и зафиксируется без использования шва.

Вручную вводите RPMI из шприца объемом 10 мл со скоростью 0,3 мл в минуту, пока не появится поток в отводящем трубке. Если поток в отводящей трубке отсутствует, измените положение канюли левого желудочка. Однако, если поток в легких отсутствует, прекратите эксперимент, так как в легочной артерии, вероятно, имеется утечка.

После того как канюляция сердца полностью завершена, подсоедините шприц объемом 60 мл к системе IL 1. С помощью насоса для обеспечения стабильного потока введите RPMI Perfuse 8 со скоростью 1 мл/мин. Проверьте отсутствие утечек во время начальной перфузии.

Продолжайте постепенно перфузировать легкие еще в течение двух минут, пока они не станут белыми. Для исследований с пульсирующим потоком сначала установите желаемый уровень перемещения поршня одиночного насоса.

Затем установите стабильную скорость потока. Теперь откройте клапан насоса osli и начните запись данных непосредственно перед запуском профиля потока osli. По завершении откройте файл вывода данных и постройте график экспериментального потока на основе данных о потоках из начального испытания.

Отрегулируйте ход поршня осциллирующего насоса для каждой частоты так, чтобы значение Q max соответствовало требуемому. Поддерживайте вентиляцию при постоянном давлении. Во время сбора данных для испытаний со стационарным потоком закройте клапан одиночного насоса и установите скорость стационарного потока на нужный уровень. Начните запись данных и выполните протокол стационарного потока пошагово.

Сбор данных следует проводить в течение не менее 10 секунд при каждой скорости потока между сериями опытов. Сбросьте скорость потока до 0,5 milliliters per minute. Убедитесь, что во время сбора данных вентиляция поддерживается при постоянном давлении.

Если требуется провести испытания при нулевом давлении в левом предсердии, во время проведения испытаний отсоедините отводящую трубку. Внимательно следите, чтобы среда RPMI не попала в трубку дыхательных путей. Не допускайте попадания RPMI в датчики давления в дыхательных путях, так как это приведет к их повреждению.

Ниже представлены результаты перфузии при стационарном потоке: в верхнем ряду указан поток Q, а во втором ряду — результирующее давление в легочной артерии и левом предсердии при различных условиях. На первых двух панелях давление в левом предсердии увеличивалось и уменьшалось в зависимости от Q, так как была установлена дренажная трубка; на первой панели показано давление воздуха в конце вдоха, а на второй — давление воздуха в конце выдоха. Затем трубку удалили, в результате чего давление в левом предсердии стало постоянным и не зависело от Q. После этого высота выходной трубки была отрегулирована вручную так, чтобы давление в левом предсердии было выше.

Однако, независимо от Q, на первой панели показано давление воздуха в конце вдоха, а на второй — давление воздуха в конце выдоха. Полученные зависимости давления в легочной артерии от потока для каждого случая можно определить, построив график зависимости давления от потока.

Ниже представлены результаты перфузии с пульсирующим потоком: на верхней панели показан поток Q, а на нижней — соответствующие значения давления в легочной артерии, левом предсердии и в воздухе. На основании этих зависимостей между пульсирующим давлением и потоком в легочных сосудах можно рассчитать импеданс легочного кровотока, который отражает общую постнагрузку на правый желудочек.

После освоения данной техники процедура занимает от 20 до 30 минут. При выполнении этой манипуляции важно не торопиться и сохранять спокойствие, чтобы руки оставались устойчивыми. Как только легкие будут достаточно перфузированы, самая сложная часть будет завершена.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как гистология или биохимические анализы тканей легких, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, какие молекулярные механизмы ответственны за наблюдаемые изменения в соотношении пульсирующего давления и кровотока в легких. Этот метод открывает исследователям в области физиологии легких возможность изучать роль специфических генов и белков в развитии и прогрессировании легочных сосудистых заболеваний с использованием генетически модифицированных мышей.