Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Целью данной процедуры является определение потенциала митохондриальной мембраны и уровней активных форм кислорода в первичных кортикальных нейронах с использованием флуоресцентных зондов TMRM и H 2D CFD соответственно. Для этого сначала готовятся стоковые и рабочие концентрации TMRM и H 2D CFDA. На втором этапе кортикальные нейроны инкубируют с TMRM и H 2D CFDA при комнатной температуре в течение 45 минут в буфере Thai roads.

Третьим этапом является регистрация интенсивности флуоресценции TMRM и DCF в живых кортикальных нейронах с использованием возбуждения 515/517 нм и 488/515 нм соответственно. Изменения флуоресценции TMR будут отслеживаться в присутствии митохондриального разобщителя FCCP, а изменения флуоресценции DCF — в присутствии перекиси водорода. Заключительным этапом данной процедуры являются сбор, нормализация и анализ данных.

В конечном итоге результаты получают путем построения графика, который показывает относительные уровни интенсивности флуоресценции TMRM и DCF соответственно до и после обработки FCCP и перекисью водорода. Здравствуйте, меня зовут Джоанна Коска. Добро пожаловать в мою лабораторию в Университете Лойола в Чикаго.

Сегодня мы покажем вам, как измерять потенциал митохондриальной мембраны и уровень активных форм кислорода в кортикальных нейронах крысы. Процедуру продемонстрирует dhi. Здравствуйте, я Дениз Джосси.

С помощью данной методики можно измерить потенциал митохондриальной мембраны с использованием метки для отдельных митохондрий, а также уровень активных форм кислорода с использованием метки для отдельных клеток. Итак, приступим. Приготовьте 10 мM стоковый раствор TMRM, растворив 5 мг TMRM в 1 мл безводного диметилсульфоксида, и перемешивайте на вортексе в течение одной минуты.

Затем разлейте раствор по аликвотам и храните их при температуре -20 °C. Беречь от света и использовать в течение одного месяца. Далее приготовьте 10 мМ стоковый раствор H 2D CFDA, растворив 4,87 мг H 2D CFDA в 1 мл безводного диметилсульфоксида.

Аналогичным образом перемешайте на вортексе в течение одной минуты, затем разделите на аликвоты и храните их при температуре -20 °C. Берегите от света и используйте в течение одной недели, чтобы сначала нагрузить кортикальные нейроны крысы TMRM. Промойте культивируемые нейроны трижды буфером Тайро.

Затем приготовьте 20 нМ раствор TMRM, разбавив 10 мМ стоковый раствор TMRM в 1000 раз в буфере tb. Затем добавьте два µL разбавленного TMRM на один mL буфера tb. Инкубируйте нейроны с TMRM в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре.

Через 45 минут установите чашку с культурой на предметный столик микроскопа и начните визуализацию, чтобы ввести H 2D CFDA в кортикальные нейроны крысы; промойте культивируемые нейроны трижды в tb. Затем приготовьте 2 µM раствор H 2D CFDA, разбавив стоковый раствор H 2D CFDA с концентрацией 10 mM в 10 раз в tb. После этого добавьте 2 µL разбавленного H 2D CFDA на 1 mL tb.

Затем инкубируйте нейроны с H 2D CFDA в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре. Перед получением изображений промойте нейроны четыре раза буфером TB для удаления избытка флуоресцентного индикатора; для проведения прижизненной визуализации нейронов, инкубированных с TMRM, используйте конфокальную лазерную сканирующую микроскопию с применением программы для записи временных серий (live time series). Используйте низкое разрешение и ослабленную мощность лазера, чтобы минимизировать время получения изображений и избежать фотообесцвечивания.

Затем с помощью отраженного света настройте фокус закрепленных нейронов, нагруженных TMRM. Проверьте флуоресценцию TMRM, используя возбуждение на длине волны 540 нм и детектирование на длине волны 570 нм. После установки всех параметров, включая разрешение, мощность лазера, усиление камеры и интервал таймлапса для получения изображений, установите усиление детектирования камеры чуть ниже уровня насыщения.

Не изменяйте эти настройки между экспериментами. Затем смените поле. Начните сбор изображений для проверки изменений стимула delta PSY M; например, можно добавить 1 µM FCCP или 2 µg/mL олигомицина, что приведет к значительной деполяризации или гиперполяризации митохондриального мембранного потенциала соответственно.

Эти изменения будут проявляться в виде снижения интенсивности флуоресценции TMRM по сравнению с базовым уровнем интенсивности флуоресценции в случае применения FCCP или в виде увеличения интенсивности флуоресценции TMRM. Для проведения живой визуализации нейронов, инкубированных с H 2D CFDA, сначала установите чашку с культурой на предметный столик микроскопа и отрегулируйте фокус клеток, используя отраженный свет. Оцените флуоресценцию DCF при возбуждении на 4 88 нм и эмиссии на 5 15 нм.

Затем установите мощность лазера на уровень от 5 до 7%, настройте усиление и разрешение 256 на 256. Не изменяйте эти параметры между экспериментами. После этого установите частоту получения изображений в режиме реального времени.

С помощью программы Time series выберите новое поле зрения и начните сбор изображений для регистрации изменений уровней R os. Обработайте клетки перекисью водорода в концентрации от 100 до 200 µM. Это проявится в увеличении интенсивности флуоресценции DCF по сравнению с базовым уровнем.

Используйте инструмент выделения области интереса (ROI) в программе LSM для выбора нужных зон. Затем выберите ROI в области митохондрий или ROI, охватывающие все тело клетки на изображениях клеток, чтобы измерить интенсивность флуоресценции TMRM или ROS соответственно.

Выберите области рядом с клетками. Для расчета интенсивности фоновой флуоресценции проведите несколько измерений, а затем с помощью Microsoft Excel вычтите среднюю интенсивность фоновой флуоресценции из средних значений интенсивности флуоресценции в областях интереса в каждой клетке для каждой временной точки, чтобы получить среднюю фоновую интенсивность. После вычитания фоновой интенсивности нормализуйте интенсивность флуоресценции TMRM или DCF относительно базового уровня флуоресценции.

Используя эту формулу, примените программу Sigma plot для построения графика, отображающего изменение интенсивности флуоресценции с течением времени. Здесь представлен пример флуоресцентного изображения кортикальных нейронов крысы, инкубированных с TMRM. Добавление митохондриального разобщителя F-C-C-P-A приводит к деполяризации митохондрий и снижению интенсивности флуоресценции TMRM.

Базовый уровень флуоресценции TMRM остается стабильным до добавления FCCP. Количественный анализ изменений флуоресценции TMRM с течением времени показывает значительное снижение флуоресценции TMRM после добавления FCCP. Ниже приведен пример изображения флуоресценции кортикальных нейронов крысы, нагруженных DCF.

Базовый уровень флуоресценции DCF остается неизменным в течение первых 120 секунд до применения перекиси водорода. Добавление перекиси водорода приводит к увеличению интенсивности флуоресценции DCF в телах клеток. Измерения флуоресценции DCF в режиме таймлапс демонстрируют стабильные уровни ее интенсивности, которые повысились после обработки перекисью водорода.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать низкую мощность лазера и высокую скорость сканирования, чтобы избежать артефактов, вызванных фотообесцвечиванием и фототоксичностью. Желаем удачи в проведении эксперимента.