Визуализация MG53-опосредованной клеточной мембраны Ремонт Использование В естественных условиях И В пробирке Системы

Общая цель данной процедуры заключается в оценке способности к восстановлению мембраны как в живом организме животного, так и в изолированных клетках. Изолированные волокна скелетных мышц собирают и помещают в среду, содержащую краситель FM 1 43. Затем с помощью УФ-лазера облучают и повреждают участок клеточной мембраны, чтобы обеспечить проникновение красителя в клетку.

Изолированные клетки трансфецируют плазмидной ДНК, экспрессирующей GFP MG 53, которая локализуется в плазматической мембране и цитозоле клетки. Затем кончик микроэлектрода вводят в мембрану C two C 12 для нанесения повреждения. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие транслокацию GFP MG 53 в место повреждения.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как для освоения техники проникновения микроэлектрода и изоляции мышечного волокна требуются соответствующие практические навыки. Процедуру продемонстрируют д-р Лин, руководитель нашей лаборатории, д-р Вазу, постдок Мэтт Оранж, аспирант, и д-р Шаза, профессор-исследователь нашего отделения. Для начала поместите лоток или синий лабораторный коврик под беговую дорожку, чтобы собирать отходы жизнедеятельности животных во время эксперимента.

Затем установите угол наклона поверхности беговой дорожки. Некоторые беговые дорожки имеют встроенный механизм регулировки наклона, в то время как для других требуется приподнять дорожку с помощью других средств. Как правило, используется плоская поверхность или угол наклона от 7 до 15 градусов вниз или вверх.

Проведите акклиматизацию мышей, поместив их на беговую дорожку при выключенной электрической сетке и включенном приводе ленты, который не должна двигаться в течение 15 минут; по завершении периода акклиматизации включите мотивационную электрическую сетку. Запустите беговую дорожку с начальной скоростью примерно пять метров в минуту. Обеспечьте животному пятиминутный период разминки, постепенно увеличивая скорость на один-два метра в минуту каждую минуту.

Повторяйте этот период разминки ежедневно в течение от 3 до 10 дней для повышения приверженности животных протоколу во время тестирования. Для проведения нагрузки до острого истощения постепенно увеличивайте скорость беговой дорожки до достижения максимальной, отслеживая признаки истощения.

Животное считается истощенным, если оно проводит более половины времени вне беговой дорожки или остается на сетке более пяти секунд подряд. Удалите истощенную мышь и зафиксируйте общее время бега. Тренировка на выносливость.

Протоколы бега начинаются с одной и той же процедуры разминки. Однако максимальная скорость обычно ниже, а время бега может быть достаточно длительным. После завершения тестирования верните мышей в их домашние клетки и очистите беговую дорожку 70% этанолом.

Выделите поверхностный слой короткого сгибателя пальцев стопы для дальнейшего анализа. Сначала сделайте разрез кожи подошвы по срединной линии, стараясь не повредить подлежащую мышцу. Затем сделайте горизонтальные разрезы и удалите кожу.

Найдите плоское белое сухожилие мышцы FDB, прикрепленное к пяточной кости. С помощью пинцета отделите, а затем перережьте сухожилие близко к месту прикрепления. Осторожно потяните сухожилие вверх, удаляя при этом всю соединительную ткань.

Найдите место, где дистальные сухожилия разделяются на сухожилия отдельных пальцев. Перережьте сухожилия в месте их соединения с более глубоким слоем мышц и извлеките m. flexor digitorum brevis (FDB). Поместите мышечный пучок FDB в 1 мл раствора коллагеназы, предварительно нагретого до 37 °C.

Прикрепите пробирку горизонтально к орбитальному шейкеру при температуре 37 °C и перемешивайте при 200 RPM в течение 65 минут. Признаком достаточного переваривания является разрыхление структуры и бледный цвет. Отрежьте кончик наконечника дозатора объемом 1 мл, чтобы переваренный пучок мог пройти сквозь него.

Аккуратно перенесите пучок в центрифужную пробирку, содержащую около 600 µL 2.5. Calcium tyro. Осторожно переверните пробирку, чтобы отделить свободные волокна от пучка.

Затем обрежьте кончик наконечника пипетки объемом 30 µL так, чтобы его диаметр был лишь немного меньше диаметра пучка мышц. С помощью этого наконечника втяните пучок в пипетку, а затем вытолкните его обратно в раствор. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока большая часть волокон не отделится от пучка.

Перемешайте диссоциированные волокна, осторожно вращая пробирку. Возьмите необходимый объем и перенесите его в чашку Delta T со стеклянным дном. Оставшиеся волокна храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение примерно шести часов для дальнейшего использования и дополнительных исследований.

Оставьте чашку в покое на пять минут. Это позволит волокнам прикрепиться к стеклянному дну чашки. Поместите чашку со стеклянным дном на конфокальный микроскоп, оснащенный УФ-лазером.

Рассматривайте волокна с помощью фазово-контрастной микроскопии при увеличении более 100 x, чтобы проверить наличие нормального рисунка поперечной исчерченности и прямой палочковидной формы. Добавьте в раствор красители стироперинума FM 1 43 или FM 4 64 до конечной концентрации 2.5 µM. Расположите волокно под углом 45 градусов от верхнего левого края поля зрения к нижнему правому для нанесения повреждения.

Облучите область плазматической мембраны размером 5×5 пикселей. Используя УФ-лазер, настроенный на максимальную мощность в течение пяти секунд, необходимо воздействовать на участок так, чтобы облучаемая область разделяла плазматическую мембрану: половина квадрата 5×5 должна находиться внутри волокна, а остальная часть — снаружи. Делайте снимки проникновения красителя в волокно с интервалом в пять секунд на протяжении пяти минут. На одну чашку можно облучить не более трех волокон, так как со временем флуоресцентный краситель подвергнется эндоцитозу в волокно, что затруднит последующий анализ данных.

После использования трех волокон следует подготовить новое блюдо. С помощью программного обеспечения для анализа рассчитайте изменение интенсивности флуоресценции на площади примерно 200 квадратных микрон для сравнения между волокнами. Для каждого кадра необходимо выполнить следующий расчет: delta F, деленное на F zero, где F zero — это средняя флуоресценция области интереса на первом захваченном кадре, а delta F — изменение флуоресценции в каждом последующем кадре.

Используйте стандартные методы для трансфекции клеток плазмидной ДНК, экспрессирующей GFP MG 53. Затем подготовьте микропипетки. Установите капилляр Pyrex на микропипетку.

Выполните вытягивание по заданной программе. Закрепите микропипетку в трех-осевом микроманипуляторе. Удалите культуральную среду из чашки delta T и замените ее буфером Тайро с 2.5 мМ кальция.

Поместите чашку с трансфицированными клетками на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с масляным иммерсионным объективом 40 x 1.3 NA. Вызовите острое повреждение живой клетки, введя микропипетку в клеточную мембрану, а затем быстро извлекая ее из клетки. Сделайте серию последовательных снимков живой клетки с интервалом 1,54 секунды на кадр для регистрации разрыва мембраны, индуцированного тропонином.

ПЕРФУЗИРУЙТЕ 0,005% тропонина со скоростью примерно 1 мл в минуту непосредственно над визуализируемой клеткой. Беговую дорожку можно использовать для измерения снижения беговой способности. У мышей с нокаутом MG 53, представленных здесь, наблюдается снижение беговой способности вследствие повреждения скелетных мышц.

Степень повреждения, вызванного УФ-лазером, зависит от способности мембраны волокна к регенерации. На данном изображении представлено волокно нормальной мыши до нанесения повреждения. Следующий снимок был сделан через 200 секунд и демонстрирует незначительное повреждение.

Мышечное волокно, полученное от мышей с нокаутом MG 53, у которых нарушена способность к восстановлению мембраны, продемонстрирует более интенсивное проникновение красителя после нанесения повреждения. Здесь представлен пример неповрежденной миотрубки C2C12, трансфицированной GFP MG 53. Стрелка на этом изображении указывает на везикулы, содержащие GFP MG 53, которые перемещаются к местам повреждения.

В данном примере для повреждения плазматической мембраны использовался сапонин. Обратите внимание на транслокацию GFP MG 53 из цитозоля к клеточной мембране после повреждения. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости выделения качественных мышечных волокон с гладкими сарколеммами и четким рисунком поперечной исчерченности.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать способность к восстановлению мембраны в мышцах и культивируемых клетках.