Простые висячей капли культуре клеток Протокол Генерация 3D сфероидов

Целью данного эксперимента является создание трехмерных тканеподобных структур (стероидов). Для этого сначала собирают культивируемые клетки, после чего готовят суспензию из отдельных клеток. Затем капли клеточной суспензии наносят на внутреннюю поверхность перевернутой крышки чашки для культивирования тканей.

Затем крышку переворачивают и устанавливают на увлажняющую камеру. Заключительным этапом является инкубация висячих капель в течение 24–48 часов для формирования агрегатов. После этого их можно перенести в встряхивающую водяную баню и инкубировать в течение еще до пяти дней.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие различия в когезии агрегатов или сортировке клеток с помощью анализов на уплотнение, оценки симметрии поверхности ткани или эпифлуоресцентной микроскопии. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как, например, традиционное 2D-культивирование тканей, является то, что клетки, выращенные в 3D, более точно имитируют клеточные взаимодействия, характерные для тканевого окружения. Я продемонстрирую этот метод, чтобы показать вам, что он настолько прост, что с ним справится даже руководитель лаборатории.

Для начала этого эксперимента соберите адгезивные клетки при 90% конфлюэнтности. Сначала аспирируйте культуральную среду и дважды промойте клеточный слой PBS. Затем аспирируйте PBS и пипеткой нанесите два миллилитра 0,05% раствора трипсина в ЭДТА на монослой.

Поместите планшет в инкубатор для культур тканей при 37 °C и инкубируйте до открепления клеток. Затем извлеките планшет из инкубатора и остановите процесс тризинизации, добавив 2 мл полной среды.

С помощью пипетки на 5 мл тритурируйте смесь до полного суспендирования клеток. Затем перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте в клеточную суспензию 40 µL раствора ДНК с концентрацией 10 mg/mL и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Кратковременно перемешайте суспензию клеток на вортексе, затем центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут. По завершении центрифугирования аспирируйте супернадант S и удалите его, после чего ресуспендируйте осадок в 1 mL полной среды для промывки. Повторите центрифугирование и ресуспендируйте осадок в 1 mL полной среды.

Затем проведите подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Доведите концентрацию клеточной суспензии средой до конечного значения 2,5 × 10⁶ клеток/мл. После этого переходите к формированию висячих капель.

Подготовьте увлажняющую камеру, сняв крышку с 60-миллиметровой чашки для культивирования тканей и внеся пипеткой 5 мл PBS на дно чашки. Переверните крышку чашки и нанесите пипеткой до 20-10 капель клеточной суспензии объемом по 1 мкл на внутреннюю сторону крышки. Убедитесь, что капли расположены на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы они не соприкасались.

Осторожно установите крышку с каплями культур обратно на чашку с PBS. Поместите планшет с культурами в инкубатор для культур тканей. Установите параметры 37 °C, 5% carbon dioxide и 95% humidity и инкубируйте в течение ночи.

Ежедневно контролируйте состояние капель и продолжайте инкубацию до образования клеточных пластов или агрегатов. После образования клеточных пластов или агрегатов перенесите их в стеклянные колбы с круглым дном, содержащие 3 mL полной среды. Инкубируйте колбы с клеточными пластами или агрегатами в shaking water bath (встряхивающей водяной бане).

Образцы выдерживают при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение примерно 24 часов, пока образование стероидов не станет заметным под стереомикроскопом. После формирования стероидов влияние экспериментальных манипуляций на их образование можно количественно оценить согласно процедуре, описанной в письменном протоколе. Также на данном этапе с помощью флуоресцентной микроскопии можно визуализировать интеркаляцию в мембрану любых предварительно добавленных флуоресцентных красителей.

На данном изображении, полученном с помощью микроскопа в светлом поле, показана агрегация клеток рака предстательной железы крысы MLL после 18 часов инкубации методом висячей капли. На снимке виден второй агрегат клеток MLL, сформировавшийся через 18 часов культивирования методом висячей капли. Данные клетки культивировались в присутствии 25 micromolar ингибитора MEK PD 9 8 0 5 9, что привело к образованию существенно более компактного клеточного агрегата.

Здесь продемонстрирована разница в размере агрегатов между культурой MLL, выращенной методом висячей капли и обработанной ингибитором MEK, и контрольными необработанными агрегатами. Звездочка указывает на статистически значимое различие при P менее 0,0001. Согласно результатам t-критерия Стьюдента для сравнения необработанных агрегатов и агрегатов, обработанных ингибитором MEK, воздействие ингибитора MEK приводит к формированию значительно более мелких и компактных агрегатов.

Данное изображение было получено с помощью стереомикроскопа Nikon Smz 800 и иллюстрирует стероид, образовавшийся в результате инкубации клеток эмбриональной печени цыпленка в культуре «висячей капли» в течение 18 часов, с последующим перемещением в шейкер-термостат при 37 °C на 48 часов. Это изображение, полученное с помощью конфокального микроскопа, демонстрирует процесс сортировки, который происходит при совместном культивировании определенных популяций клеток методом «висячей капли»; перед началом культивирования в «висячей капле» клетки эмбриональной печени цыпленка были окрашены мембранным интернализирующим красителем pkh two.

Клетки сердца окрашивали красителем PKH 26. Затем клеточные суспензии смешивали и выносили в виде висячих капель. Культивирование проводили в течение 18 часов, после чего образцы инкубировали в течение 48 часов в шейкере-термостате при температуре 37 °C.

На оптическом срезе видно, что окрашенные желтым цветом клетки сердца окружены клетками печени. Здесь псевдо-окрашены синим два клона клеток L nardi, экспрессирующих NCA на своей поверхности. В соотношении 2,4 к одному их окрашивали флуоресцентными мембранными красителями PKH 2 и PKH 26, смешанными в равных пропорциях, и культивировали в виде висячих капель, как описано ранее.

В данном примере клетки с высокой экспрессией E-кадгерина, окрашенные в зеленый цвет, окружены клетками с более низким уровнем экспрессии E-кадгерина, окрашенными в красный цвет. После освоения эта техника может быть выполнена за 30 минут или быстрее при условии правильного проведения процедуры.