Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии
3 мая 2011 г.
Оптическое разрешение ФА микроскопии (ИЛИ-PAM) является новая технология способна изображений оптического поглощения контрастов В естественных условиях С сотовыми разрешение и чувствительность. Здесь мы предоставляем визуализированы инструкции по экспериментальным протоколам ИЛИ-PAM, включая конфигурацию системы, системы выравнивания, типичные В естественных условиях Экспериментальных процедур и функциональных схем визуализации.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать метод оптоакустической микроскопии (ОАМ) с оптическим разрешением для неинвазивной и безмаркерной визуализации микроциркуляции in vivo. Для этого сначала проводят анестезию подопытного животного. На втором этапе процедуры область интереса позиционируют путем перемещения измерительной головки оптоакустического микроскопа с оптическим разрешением, после чего устанавливают параметры сканирования и запускают процесс получения изображений.
В конечном итоге распределения общей концентрации кислорода и насыщения гемоглобина кислородом определяются путем вычислений на основе экспериментальных данных, полученных на нескольких длинах волн. Оптическая разрешающая фотоакустическая микроскопия основана на лазерном возбуждении и ультразвуковом детектировании. Короткий лазерный импульс фокусируется в биологическую ткань.
Поглощение света вызывает кратковременный нагрев и последующее ультразвуковое излучение, которое регистрируется для формирования изображения. Уникальное преимущество фотоакустической микроскопии (PAM) заключается в бесконтактном детектировании и исключительной чувствительности к оптическому поглощению. Напротив, существующие технологии рефлексионной и оптической микроскопии в основном чувствительны к оптическому рассеянию или флуоресценции. Способность обеспечивать безмаркерную визуализацию оптического поглощения с высоким разрешением in vivo позволила PAM найти широкое биомедицинское применение в неврологии, офтальмологии, биологии сосудов и дерматологии.
Фотоакустическая микроскопия с оптическим разрешением (pamm) состоит из оптического и ультразвукового компонентов. Источником оптического излучения служит красильный лазер с накачкой твердотельным импульсным лазером. Выходной лазерный луч ослабляется фильтром нейтральной плотности и вводится в одномодовое оптическое волокно для доставки света, что позволяет осуществлять механическое сканирование измерительной головки микроскопа, а не самого живого объекта, для эффективного ввода многомодового лазерного луча в одномодовое оптическое волокно.
Сначала свет фильтруется через диафрагму с отверстием диаметром 50 мкм. Диафрагма расположена с небольшим смещением относительно фокуса конденсорного объектива, чтобы её диаметр соответствовал диаметру пучка основной моды. Для создания оптического фокуса, близкого к дифракционному пределу, выходной сигнал одномодового волокна коллимируется и заполняет заднюю апертуру объектива микроскопа.
Ультразвуковая детекция осуществляется с помощью самодельного акустооптического объединителя лучей, подключенного к ультразвуковому преобразователю. Объединитель обеспечивает коаксиальное совмещение оптического облучения и акустического детектирования. В нижней части объединителя выточена сферическая полость, образующая акустическую линзу с числовой апертурой 0,5 в воде, что обеспечивает диаметр акустического фокуса 43 мкм при центральной частоте 50 МГц.
Для первоначальной юстировки полезно использовать ультразвуковой импульс-эхо метод для определения положения акустической фокальной плоскости. Головка сканирования перемещается вертикально до достижения максимального амплитуды сигнала ультразвукового эхо-импульса. Для обеспечения максимальной чувствительности детектирования выполняется совмещение оптического и акустического фокусов. Конфокальность.
Оптически поглощающая мишень, например, кусочек черной изоленты, помещается в плоскость акустического фокуса. Затем настраивается положение оптического фокуса для максимизации фотоакустического сигнала. Система PAM также включает электронные усилители и аналого-цифровой преобразователь, механический сканер и контроллер сканера.
Оцифрованный сигнал передается на компьютер для формирования изображения. Программное обеспечение преобразует необработанные данные в последовательность поперечных срезов. По мере того как головка микроскопа выполняет растровое сканирование объекта, записанные изображения могут быть представлены в виде отдельных поперечных срезов, 2D-проекций максимальной амплитуды или 3D-визуализаций.
Для размещения головки микроскопа для визуализации используется резервуар с водой. В чашке Петри вырезается окно для визуализации, которое герметизируется ультразвуко- и оптически прозрачной полиэтиленовой мембраной. Фотоакустическая волна, генерируемая объектом, передается на ультразвуковой детектор сначала через ультразвуковой гель между объектом и полиэтиленовой мембраной, а затем через деионизированную воду в чашке Петри.
Эти изобретения и способы применения доступных оптических лазеров и ультразвукового преобразователя составляют систему ОРAM. В следующем сегменте мы с помощью этой системы визуализируем микрососудистую сеть живой мыши. Если визуализируемое животное не является голым видом мыши, за 24 часа до эксперимента желательно провести депиляцию.
Таким образом, раздражение сосудов кожи купируется. Мышь наркотизировали 3% ISO, распыленным в медицинском кислороде. Типичная скорость потока составляет от 1 до 1,5 литров в минуту.
Дозировка зависит от массы тела животного. Поддерживайте анестезию 1% ISO-флураном на протяжении всего эксперимента, периодически выполняя щипковый тест (надавливание на пальцы лапы), чтобы убедиться в достаточности глубины наркоза у мыши. Переместите мышь на стереотаксическую установку с нагревательным ковриком для поддержания температуры тела на уровне 37 °C.
Теперь прижмите ухо к пластине. Затем нанесите слой ультразвукового геля поверх уха. Старайтесь не допускать образования пузырьков воздуха в геле.
Также нанесите в глаза офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить пересыхание или случайное повреждение лазером. Избегайте прямого касания глаза аппликатором. Затем поместите ухо под окно визуализации и медленно поднимайте столик с животным, пока ультразвуковой гель не вступит в контакт с нижней частью мембраны.
Необходим мягкий контакт, так как прижатие ушной раковины к мембране может повлиять на кровоток в ухе. Далее примите несколько мер предосторожности при работе с животным для мониторинга его физиологического состояния. Закрепите пульсоксиметр на лапке или хвосте мыши.
Теперь опустите головку визуализации до тех пор, пока акустическая линза не будет погружена в деионизированную воду, и удалите пузырьки воздуха, скопившиеся под акустической линзой. Переведите лазер в режим внешнего триггера и начните пробное сканирование. Отрегулируйте положение головки визуализации по оси Z так, чтобы оптический и акустический двойные фокусы находились в центре ушной раковины.
Теперь установите параметры сканирования и начните формальный сбор изображений. Для измерения общей концентрации гемоглобина установите длину волны на изобестическую точку, при которой оксигемоглобин и дезоксигемоглобин имеют равные коэффициенты молярной экстинкции.
Для измерения насыщения гемоглобина кислородом установите вторую длину волны таким образом, чтобы молярные коэффициенты экстинкции оксигемоглобина и дезоксигемоглобина имели выраженное различие. По завершении очистите ухо мыши и поместите животное в инкубатор. При температуре окружающей среды 37 °C, после пробуждения мыши, верните ее в виварий.
На этом изображении с максимальной амплитудной проекцией показана сосудистая анатомия уха живой мыши линии «nude», полученная с помощью оРАМ на длине волны 570 нанометров. На данном проекционном изображении показана сатурация гемоглобина кислородом в том же ухе. Она рассчитана на основе изображений, полученных на изосбестической длине волны 570 нанометров и длине волны 561 нанометров, где доминирует поглощение дезоксигемоглобина.
Более детальное рассмотрение области, обведенной рамкой, демонстрирует разрешение ORPM. Четко визуализируется плотная сеть капилляров. В данном видео мы продемонстрировали типичный экспериментальный протокол ORPM, включая конфигурацию системы, юстировку системы, процедуру эксперимента in vivo и схему функциональной визуализации.
Одним из наиболее важных аспектов проектирования и эксплуатации прибора является оптико-акустическое конфокальное совмещение, которое имеет решающее значение для чувствительности визуализации и оптического разрешения. Фотоакустическая микроскопия в сочетании с глубоко проникающей акустической микроскопией и фотоакустической компьютерной томографией открывает перспективы для функциональной и молекулярной визуализации in vivo на различных масштабах: с использованием одного и того же контраста можно получить изображения структур от размера клеток и тканей до целых органов. Такая масштабируемость визуализации обладает потенциалом произвести революцию в исследованиях многомасштабных биологических систем и в трансляционной медицине — от микроскопических открытий в лаборатории до макроскопической клинической практики.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол оптического разрешения фотоакустической микроскопии (OR-PAM) — неинвазивного метода визуализации, обеспечивающего клеточное разрешение in vivo. Процедура включает анестезию животного, позиционирование головки сканирования и получение изображений для анализа микроциркуляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы визуализации
- Фотоакустическая микроскопия
Введение
- OR-PAM — это новая технология визуализации.
- Она позволяет получать изображения контрастов оптического поглощения.
- Данный метод не требует использования меток и является неинвазивным.
- Он позволяет получить представление о микроциркуляции и уровнях кислорода в тканях.
Цель исследования
- Продемонстрировать использование ОР-ПАМ in vivo.
- Предоставить визуализированную инструкцию по экспериментальным протоколам.
- Углубить понимание динамики микроциркуляции.
Используемые методы
- Анестезия экспериментального животного.
- Позиционирование области интереса для визуализации.
- Настройка параметров сканирования для получения изображений.
- Вычисление общей концентрации и сатурации кислорода на основе многоволновых данных.
Основные результаты
- Успешная визуализация микроциркуляции in vivo.
- Получение данных о концентрации и насыщении кислородом.
- Демонстрация неинвазивности данного метода.
- Валидация OR-PAM как инструмента для функциональной визуализации.
Выводы
- OR-PAM эффективен для визуализации микроциркуляции.
- Данный метод предоставляет ценную информацию об оксигенации тканей.
- Он имеет потенциал применения в различных областях биомедицинских исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Трехмерная фотоакустическая микроскопия с оптическим разрешением (OR-PAM) обеспечивает неинвазивную бесконтрастную визуализацию оптического поглощения тканей с высоким разрешением, позволяя получить функциональные и физиологические данные на уровне микроциркуляторного русла. Эта возможность восполняет критический пробел в визуализации на этапе первичных открытий, позволяя количественно оценивать оксигенацию и динамику гемоглобина in vivo, что способствует снижению механистических рисков и обеспечению трансляционной преемственности. Интеграция оптического и акустического детектирования в системе OR-PAM представляет особую ценность для валидации мишеней и повышения прогностической достоверности в рамках доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию оксигенации тканей и насыщения гемоглобина для функционального анализа мишеней.
- Помогает снизить биологические риски путем количественной оценки физиологических реакций в интактной микроциркуляторном русле.
- Повышает прогностическую уверенность в воздействии на мишень благодаря количественным результатам безмаркерной визуализации.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные модели in vivo для последующего скрининга соединений и изучения механизмов действия.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные измерения функции и оксигенации микрососудов.
- Обеспечивает стандартизацию анализа и масштабируемость платформы для рабочих процессов высококонтентного имиджинга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты визуализации с физиологическими биомаркерами, имеющими значение для заболевания, такими как сатурация кислорода.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет поддержки многомасштабной функциональной визуализации.
- Снижает риски при принятии решений о дальнейшем продвижении за счет возможности прямого измерения фармакодинамики на уровне тканей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод OR-PAM вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая ранние исследования механизмов с трансляционной валидацией биомаркеров с помощью количественной визуализации in vivo.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем измерения физиологических изменений в микроциркуляции в режиме реального времени.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую визуализацию параметров сосудов и оксигенации, готовую для анализа, с целью оценки соединений.
- Аналитика: генерирует количественные показатели концентрации гемоглобина и сатурации кислородом для достоверного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: связывает данные функциональной визуализации со стратегиями поиска доклинических биомаркеров при использовании моделей заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу визуализации для многомасштабных и многоорганных функциональных исследований в рамках различных программ НИОКР.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы визуализации для исследований in vivo.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления практически значимых физиологических данных.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию и продвижение кандидатов с учетом рисков на основе данных функциональной визуализации.
Особенности реализации
- Требуется опыт в юстировке оптических и акустических систем, а также в протоколах визуализации in vivo.
- Необходим доступ к специализированному лазерному, ультразвуковому оборудованию и приборам для сбора данных.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров визуализации и рабочих процессов анализа данных.
- Может потребоваться адаптация под разные типы тканей или модели животных в зависимости от их оптических свойств.
- Чувствительность и разрешение визуализации зависят от точной оптико-акустической конфокальной юстировки.
