Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении нескольких культур макрофагов из смешанных первичных культур клеток печени крысы без необходимости использования сложного оборудования или специальных навыков. Это достигается сначала путем диссоциации клеток печени взрослой крысы при перфузии коллагеназой с последующим выделением паренхиматозной фракции гепатоцитов. Затем клетки инкубируют в культуральных флаконах T 75 с ростовой средой для создания смешанных первичных культур клеток печени.

Затем, после 10–12 дней культивирования, флаконы встряхивают для облегчения переноса макрофагов в пластиковые чашки, из которых их затем собирают путем селективной адгезии после короткого периода инкубации. В конечном итоге более 10 из шести типов клеток можно многократно собирать из одних и тех же флаконов для культивирования тканей T 75 с интервалом в два-три дня на протяжении более двух недель. Методы выделения макрофагов печени хорошо описаны.

Однако большинство предыдущих методов требуют наличия сложного оборудования, такого как центрифужный сепаратор, а также высокого уровня технических навыков. В данной работе мы представляем простой и новый метод получения макрофагов печени в достаточном количестве и степени чистоты из смешанных первичных культур клеток взрослой печени, который не требует специального оборудования или продвинутых лабораторных навыков. Процедуры вскрытия животного, перфузии печени и подготовки цитов будут продемонстрированы докторами Норко, Яманакой и Мико Йошиокой в Национальном институте здоровья животных.

Далее доктор Такэто Такэно из Национального института агробиологических наук продемонстрирует выделение и очистку макрофагов печени из культурного материала. Итак, приступим. Для подготовки к перфузии печени крысы начните с предварительного нагрева одного флакона с промывочным раствором и одного флакона с раствором коллагеназы.

Затем, подтвердив седацию путем сжатия кожи, поместите анестезированную взрослую крысу самца в лоток из нержавеющей стали и распылите 70% ethanol на область живота и грудной клетки. Далее с помощью диссекционных ножниц сделайте небольшой разрез посередине живота и отслоите кожу. Затем вскройте брюшную полость ножницами и определите местоположение воротной вены.

Затем проведите хирургическую нить под воротной веной и слегка затяните её. После этого зажмите дистальный отдел нижней полой вены и брыжеечной вены зажимом типа «москит», чтобы предотвратить рефлюкс крови в печень. Вскройте грудную полость, разрезав диафрагму ножницами, и обнажите сердце; затем, сделав небольшой разрез в воротной вене офтальмологическими ножницами, введите в вену пластиковый катетер диаметром 2 мм и плотно завяжите нить вокруг катетера.

Залейте в перфузионную систему предварительно нагретый промывочный раствор, после чего подсоедините ее к катетеру. Начните перфузию в C two со скоростью 10 milliliters per minute. Одновременно с этим сделайте разрез в стенке правого предсердия с помощью препаровальных ножниц.

Продолжайте перфузию в течение 10 минут, затем замените перфузионный раствор на раствор коллагеназы и проводите перфузию от 10 до 20 минут. Со скоростью 10 мл/мин наполните стерильный стакан 25 мл раствора коллагеназы. Затем извлеките перфузируемую печень и осторожно поместите ее в стакан.

Измельчите печень ножницами на мелкие фрагменты. Добавьте 75 milliliters холодного MEM в полученную суспензию клеток. После осторожного пипетирования профильтруйте суспензию через клеточный фильтр с размером пор 100 micrometer.

Для удаления соединительной ткани из непереваренных фрагментов ткани соберите фильтрат в конические пробирки объемом 50 мл. Перенесите фильтрат в конические пробирки объемом 50 мл и промойте клетки четыре раза, предварительно центрифугируя их при 50 G в течение одной минуты при температуре 4 °C. После остановки центрифуги осторожно слейте супернатант, затем ресуспендируйте осадок в холодном MEM и снова центрифугируйте клетки после последнего этапа промывки.

Ресуспендируйте клетки печени в ростовой среде. Затем высейте клетки в пять-десять флаконов для культивирования тканей T 75 с плотностью 6,7 × 10⁴ клеток на квадратный сантиметр. Поместите флаконы с культурой в инкубатор и заменяйте ростовую среду каждые два-три дня.

После одного дня культивирования паренхиматозные гепатоциты распределяются по поверхности флакона и приобретают типичную полигональную морфологию, напоминающую копал, с одним или двумя круглыми ядрами. Через несколько дней культивирования паренхиматозные гепатоциты теряют морфологию эпителиальных клеток и трансформируются в более плоские фибробластоподобные клетки. Примерно на шестой день при фазово-контрастной микроскопии на слое фибробластоподобных клеток начинают пролиферировать светлые округлые макрофагоподобные клетки. Рост макрофагоподобных клеток достигает максимального уровня примерно к 12-му дню.

Количество макрофагоподобных клеток снижается примерно к 19-му дню, когда фибробластический клеточный пласт начинает подвергаться дегенерации. Таким образом, спустя семь-десять дней культивирования, после ресуспендирования макрофагов, мы переводят макрофаги, пролиферировавшие на клеточном пласте, в культуральную среду путем взаимного встряхивания культуральных флаконов в течение 30 минут. Заполните каждую 100-миллиметровую пластиковую чашку (не предназначенную для культивирования тканей) средой из двух флаконов T 75.

Долейте в культуральные колбы ростовую среду и верните их в инкубатор. Инкубируйте пластиковые чашки в течение 30 минут после периода инкубации, затем промойте чашки трижды, аспирируя среду и осторожно промывая пластиковую чашку PBS, как показано здесь; уже через 10 минут после посева макрофагоподобные клетки прикрепляются к поверхности чашки, в то время как другие contaminating фибробластические клетки остаются во взвешенном состоянии. После промывки PBS получается высокоочищенная популяция макрофагов.

Как видно на этом рисунке, через 40 минут культивирования клетки приобретают типичную морфологию макрофагов, а также часто наблюдаются клетки в состоянии митоза, на что указывают стрелки. Чтобы собрать эту новую высокоочищенную популяцию макрофагов, добавьте один миллилитр раствора TripLE Express к промытым клеткам и поместите чашки обратно в инкубатор еще на 10 минут. После этого периода инкубации добавьте девять миллилитров ростовой среды, затем аккуратно снимите прикрепленные макрофаги с помощью скребка для клеток, перенесите их в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и удалите супернатант.

Добавьте 1 mL ростовой среды, разбейте ресуспендированные клеточные агрегаты до состояния одиночных клеток путем интенсивного пипетирования, определите количество клеток с помощью гемоцитометра, как показано на данном графике; более 10⁶ клеток можно многократно собирать из культурального флакона T 75 с интервалом в два-три дня на протяжении более двух недель, что позволяет получить общий выход клеток от 10⁷ на один флакон T 75. Как показано на этих изображениях, изолированные клетки подвергнуты иммуноокрашиванию моноклональными антителами к антигенам макрофагов крысы, таким как CD 68 или ED 1 и CD 1 72 A или OX 41. Эти клетки обладают функциональными свойствами макрофагов, такими как активный фагоцитоз микросфер, меченных FITC.

В данном видео мы представили простой и эффективный метод получения макрофагов из смешанных первичных культур клеток печени взрослых особей. Наша процедура не требует сложного оборудования или специальных навыков, однако позволяет получить достаточное количество чистых макрофагов, которые можно многократно собирать из одной и той же культуры. Данный метод может быть применен и к другим видам млекопитающих.

Благодарим вас за просмотр видео и желаем успехов в ваших будущих экспериментах. Всего доброго.