Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Общая цель данной процедуры заключается в нокдауне экспрессии целевого гена в DCS с помощью трансфекции siRNA. Это достигается путем предварительного программирования эффектора AM Maxin Nucleo. Вторым этапом процедуры является смешивание DCS и siRNA с последующим переносом полученной клеточной суспензии в модули Nucleo QVE с помощью пипетки.

Третьим этапом процедуры является помещение планшета в лоток челнока amaxa для начала процесса трансфекции. Заключительным этапом процедуры является инфицирование клеток вирусом для активации интерферонового ответа. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие нокдаун гена с помощью количественной R-T-P-C-R и вестерн-блоттинга.

Данный метод представляет ценность для характеристики сигнальных путей в дендритных клетках и может способствовать разработке иммунотерапии на основе дендритных клеток. Чтобы запрограммировать нуклеофактор Maxon с 96-луночным держателем для трансфекции дендритных клеток, откройте новый файл параметров. Выберите количество лунок, которые будут использоваться для стандартной трансфекции, переместив курсор по диаграмме 96-луночного планшета.

Для каждого экспериментального образца используйте для объединения не менее трех лунок. Теперь введите код программы: в первой части выберите F, F, а во второй части выберите 1 68 из выпадающих меню. Затем в окне выбора раствора выберите monocyte human, далее в параметрах контроля выберите standard и нажмите apply.

Для включения контроля без трансфекции необходимо выбрать дополнительные лунки на диаграмме. Затем в опциях контроля выберите контроль без программы и снова нажмите «применить». После перемешивания раствора для нуклеофекции дайте ему нагреться до комнатной температуры.

Поместите необходимое количество модулей nucleo vete в планшет nucleo VETE в правильной ориентации, как показано здесь: вставьте первый модуль в лунки один и два, и затем повторите это для всех последующих трубок. Перенесите из флакона с клеточной культурой в пробирку объемом 50 мл достаточное количество DCS, чтобы обеспечить наличие 500 000 клеток на лунку для трансфекции. Центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 400 G и 4 °C, затем осторожно удалите супернатант. Далее добавьте в пробирку раствор для нуклеофекции и ресуспендируйте DCS, аккуратно пропипетировав содержимое несколько раз.

Теперь промаркируйте пробирки DPH в соответствии с конкретной обработкой, которую необходимо провести, а затем распределите ресуспендированные клетки по промаркированным пробиркам. Добавьте siRNA до конечной концентрации 0,25 мкг на 500 000 клеток в соответствующие пробирки, затем перемешайте клеточные суспензии путем пипетирования. Для контрольного образца без трансфекции используйте нецелевую siRNA.

Затем с помощью пипетки внесите 20 µl суспензии клеток SI RA DC в модули NucleoVet в соответствии с заранее запрограммированной схемой эксперимента, следя за тем, чтобы жидкость была доставлена на дно лунки; накройте планшет NucleoVet крышкой и несколько раз аккуратно постучите им по твердой поверхности, чтобы удалить пузырьки воздуха для трансфекции DC. Поместите подготовленный планшет NucleoVet в лоток-челнок NucleoEffector на 96 лунок. Затем нажмите кнопку «upload and start».

Следите за ходом процесса трансфекции на дисплее. Черный крестик на зеленом фоне означает успешную трансфекцию в данной лунке, тогда как черная полоса на красном фоне указывает на неудачу в процессе трансфекции клеток. После завершения процесса трансфекции прогрейте ростовую среду DC, извлеките планшет и добавьте по 80 microliters предварительно прогретой ростовой среды DC в каждую лунку.

Используя многоканальный дозатор, инкубируйте планшет в течение 10 минут при 37 °C и 5% CO2. Во время инкубации добавьте 100 µL предварительно прогретой ростовой среды DC в матричные пробирки, соблюдая ту же ориентацию, что и при подготовке планшета с Nucleo Cuvette. После завершения инкубации перенесите все 100 µL клетоких суспензий из Nucleo CVE в соответствующие матричные пробирки.

Затем извлеките и утилизируйте те пробирки, в которых трансфекция не произошла. В завершение инкубируйте пробирки с матрицей в течение 24 часов или иного требуемого интервала времени. Подготовьте маркированные пробирки Einor для каждой из инкубируемых пробирок с матрицей.

Затем перенесите матричные пробирки из инкубатора в ламинарный шкаф для культивирования клеток и объедините содержимое пробирок для каждого экспериментального образца в предварительно маркированные пробирки eend dfs. Далее осторожно осадите клетки, центрифугируя пробирки eend DPH в настольной центрифуге в течение 10 минут при 400 G. Удалите snat и аккуратно ресуспендируйте клетки в безсывороточной ростовой среде, содержащей вирус болезни Ньюкасла или NDV с MOI равным одному.

Стерильным способом перенесите эпи-эндорфины, затем инкубируйте пробирки в течение 45 минут. После этого периода инкубации добавьте 900 µL среды для роста DC и повторно инкубируйте пробирки еще от 8 до 10 часов, чтобы собрать трансфицированные и инфицированные DC.

Осадите клетки, центрифугируя пробирки в настольной центрифуге, как и прежде, и удалите супернатант. Моноцитарные дендритные клетки (DCs) были трансфицированы либо siRNA, нацеленной на RIG-I, либо неспецифической glow siRNA, и инфицированы NDV (отмечено знаком «плюс») или остались неинфицированными (отмечено знаком «минус»). Методом количественной RT-PCR было обнаружено снижение уровня экспрессии RIG-I на 75% на уровне транскрипции; аналогичное снижение экспрессии интерферона-бета, нижестоящего эффектора RIG-I в каскаде передачи сигнала интерферона, также наблюдалось. Кроме того, экспрессия интерферона-бета в неинфицированных контрольных трансфицированных клетках не была обнаружена.

В то же время ответ гена MXA и нижележащих генов ответа на интерферон бета был минимальным. Здесь представлены данные повторного transfection DCS с использованием rigi-таргетной irna, выполненного аналогично предыдущему рисунку. Однако в данном эксперименте все клетки были инфицированы NDV, а также был добавлен дополнительный контроль с использованием нерезецированных моноцитарных DCS.

Результаты сайленсинга генов были аналогичны тем, что наблюдались на предыдущем рисунке. Вестерн-блоттинг с зондированием на RGA показал, что экспрессия белка этого гена была полностью заблокирована. В дорожках один и две представлены данные для лизатов нерезецированных клеток.

Дорожки три и четыре содержат лизаты клеток, трансфицированных контрольной siRNA (glow irna), а дорожки пять и шесть — лизаты клеток, трансфицированных siRNA, нацеленной на RIG I. После освоения данная методика может быть выполнена за один час, включая одновременный нокдаун нескольких генов.