Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения
1 декабря 2011 г.
Протокол описывает высокой пропускной подход к определению структуры мембранных белков использованием крио-электронной томографии и 3D обработки изображений. Он содержит подробную информацию об образце подготовки, сбора данных, обработки и интерпретации данных, и заключает с производством представитель мишенью для подходом, ВИЧ-1 Конверт гликопротеин. Эти процедуры расчетов разработаны таким образом, что позволяет исследователям и студентам работать удаленно и вносить вклад в обработку данных и структурного анализа.
Более 60 миллионов человек были инфицированы ВИЧ — вирусом, вызывающим СПИД. ВИЧ/СПИД представляет собой глобальный кризис здравоохранения, и хотя интенсивные исследовательские усилия значительно продлили жизнь инфицированных людей, создание полноценной вакцины по-прежнему остается труднодостижимой задачей. Основным направлением исследований по созданию вакцицин против ВИЧ является изучение гликопротеина оболочки, который вирус использует для проникновения в клетки-мишени.
В этом видео мы демонстрируем процесс получения структур этого важного белка с помощью метода визуализации, называемого криоэлектронной томографией. Начиная с очищенного ВИЧ, мы показываем этапы подготовки замороженных образцов, этапы регистрации электронно-микроскопических изображений этих образцов и этапы преобразования полученных изображений в структурные модели, которые могут быть полезны при разработке вакцин против ВИЧ/СПИДа. Уникальной особенностью данного видео является то, что работа будет продемонстрирована сотрудниками ее лаборатории самого разного возраста: от учащихся средних и старших классов, студентов колледжей и аспирантов до постдокторантов и ведущих ученых.
Подготовка витрифицированных образцов вирусов, подходящих для криоэлектронной томографии, осуществляется путем нанесения водной суспензии вирусов на небольшие отверстия в углеродной пленке на медной сетке с последующим быстрым замораживанием вирусов. Цель этого этапа — подготовить замороженный образец неповрежденных вирусов, зафиксированных в состоянии, близком к нативному. Для начала сетки помещают в установку для глоу-разряда.
Данный прибор очищает сетки путем их воздействия ионизированным газом. После того как сетки готовы к использованию, подготавливают суспензию вирусов, смешанную с мелкими частицами золота. Эти частицы необходимы для сбора и обработки данных.
Затем на свежеочищенную плазмой сетку наносят каплю вирусной суспензии. Сетку помещают в робот, который промакивает ее фильтровальной бумагой, превращая каплю в тонкую жидкую пленку. После этого образец погружают в жидкий этан, что обеспечивает стремительную заморозку вирусов со скоростью более 100 000 K/s.
Затем витрифицированная сетка переносится в контейнер для хранения и транспортировки к микроскопу. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет заморожено необходимое количество сеток. После подготовки сеток с образцами вируса следующим шагом является их загрузка в микроскоп.
Визуализацию можно проводить вручную или с помощью роботизированных систем. При ручной загрузке сеток с образцами пользователь работает на специализированной станции, где манипуляции с образцами осуществляются в жидком азоте; образцы помещаются в переносную камеру с азотным охлаждением, которая герметизируется, откачивается и затем присоединяется к микроскопу. Современные микроскопы поддерживают более автоматизированную загрузку образцов.
В данном микроскопе Titan Cryo пользователь подает замороженные образцы, которые затем роботизированным способом загружаются в микроскоп вместе с сетками для образцов. Перед началом съемки пользователь может осмотреть каждую сетку. Параметры микроскопа настраиваются для каждой области на сетке образца, содержащей интересующие объекты.
В данном случае объектами анализа являются вирусы ВИЧ. По мере определения каждой новой области компьютер микроскопа сохраняет параметры визуализации, специфичные для этой области. После того как пользователь определит все интересующие его позиции, компьютер автоматически вернется в каждую из них и соберет набор данных.
Каждый набор данных собирается путем наклона сетки с образцом относительно электронного пучка, при этом обеспечивается фокусировка пучка в одной и той же точке на сетке. Традиционно сбор данных в электронной микроскопии требовал от пользователей присутствия у микроскопа и физического взаимодействия с оборудованием. Такой способ взаимодействия с микроскопом показан здесь во время визита президента Обамы на завод Intel.
Последние достижения в области компьютерных интерфейсов микроскопов позволяют пользователям контролировать и корректировать процесс сбора данных в режиме реального времени с удаленного компьютера в лаборатории или из любого другого места. Чтобы визуализировать форму оболочки и гликопротеиновых шипов, необходимо усреднить информацию из сотен отдельных изображений для усиления сигнала. Это ресурсоемкий вычислительный процесс, который в данной работе осуществляется с помощью компьютерного кластера Bio Wolf.
В Национальных институтах здравоохранения (NIH) были разработаны мощные методы извлечения отдельных объемов и усреднения информации с помощью алгоритмов, способных работать при высоком уровне шума. Карты плотности, полученные как для нативных вирусов, так и для вирусных комплексов с биологически значимыми молекулами, что характерно для данных такого типа, представляют собой богатую базу данных о структурной биологии HIV. Эти карты плотности приобретают молекулярную детализацию при объединении данных с результатами рентгеновской кристаллографии отдельных субъединиц, составляющих шип оболочечного гликопротеина.
Данные, получаемые в результате такой томографии, могут быть очень плотными, что затрудняет их интерпретацию. Для визуализации 3D-моделей можно использовать программное обеспечение для индустрии развлечений, добавляя цвета, текстуры и освещение, что упрощает их анализ. К наиболее часто используемому ПО для визуализации относятся 3ds Max и Maya.
Мы только что продемонстрировали пошаговые процедуры получения молекулярных моделей структуры оболочечного гликопротеина, начиная с очищенного ВИЧ. С помощью этого метода мы также определили структуры оболочечного гликопротеина в комплексе с различными молекулами, которые способны связываться с вирусом и нейтрализовать его.
Здесь мы приводим пример структуры гликопротеина оболочки в комплексе с антителом B12. Понимание того, почему одни молекулы могут связываться с вирусом и воздействовать на него, а другие — нет, имеет большое значение для рационального дизайна вакцин. Определение молекулярных структур гликопротеинов оболочки ВИЧ или других вирусов, таких как грипп и Эбола, является ключом к пониманию механизмов проникновения вируса в клетку и его использования.
Как вы уже видели, криоэлектронная томография в настоящее время становится мощным инструментом для достижения этой цели.
Обзор
В данном протоколе описывается высокопроизводительный метод определения структуры мембранных белков, в частности гликопротеина оболочки ВИЧ-1, с использованием криоэлектронной томографии. В нем подробно изложены этапы подготовки образцов, сбора и обработки данных, что позволяет осуществлять удаленное сотрудничество в области структурного анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Нейробиология
- Иммунология
Обзор
- Более 60 миллионов человек инфицированы ВИЧ, что представляет собой серьезный глобальный кризис в области здравоохранения.
- Оболочечный гликопротеин ВИЧ имеет решающее значение для проникновения вируса в клетки хозяина.
- Несмотря на обширные исследования, создание эффективной вакцины по-прежнему остается труднодостижимой задачей.
- Понимание структуры этого белка жизненно важно для разработки вакцин.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод получения структур оболочечного гликопротеина ВИЧ.
- Показать участие исследователей различного образовательного уровня.
- Углубить понимание механизмов проникновения вируса для рационального дизайна вакцин.
Используемые методы
- Подготовка замороженных образцов очищенного ВИЧ для визуализации.
- Использование криоэлектронной томографии для получения структурных данных.
- Обработка данных с помощью передовых вычислительных методов.
- Визуализация 3D-моделей с использованием программных инструментов анализа.
Основные результаты
- Успешная визуализация структур гликопротеина оболочки ВИЧ.
- Разработка карт плотности, раскрывающих молекулярные детали.
- Интеграция данных из различных источников для углубления структурного понимания.
- Идентификация взаимодействий при связывании с антителами и другими молекулами.
Выводы
- Криоэлектронная томография является мощным инструментом для изучения вирусных белков.
- Данный метод способствует удаленному сотрудничеству в области структурной биологии.
- Понимание структуры гликопротеинов оболочки является ключом к разработке вакцин.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Определение молекулярной структуры гликопротеинов оболочки ВИЧ обеспечивает критически важную валидацию мишеней для разработки противовирусных терапевтических средств. Криоэлектронная томография позволяет проводить структурный анализ нативных вирусных комплексов с высоким разрешением, что способствует снижению механистических рисков при разработке вакцин и антител. Этот подход повышает точность прогнозирования, выявляя конформационные состояния, имеющие значение для проникновения вируса в клетку и его нейтрализации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать конформацию спайк-белка ВИЧ и интерфейсы связывания с рецепторами.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством визуализации взаимодействий гликопротеинов с CD4 и корецепторами.
- Прогностическая ценность: облегчает оценку эпитопов связывания антител для идентификации ведущих соединений при разработке вакцин.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать карты плотности, которые служат структурными ориентирами для картирования эпитопов и характеристики сайтов связывания.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированные рабочие процессы подготовки образцов и сбора данных, подходящие для высокопроизводительного анализа.
- Полезность платформы: адаптируема для других вирусных мембранных белков, что поддерживает широкое применение в программах по поиску противовирусных средств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: интеграция данных крио-ЭТ с рентгеновской кристаллографией для построения точных моделей гликопротеиновых комплексов.
- Трансляционная преемственность: предоставление структурных данных, которые лежат в основе рационального дизайна иммуногенов и нейтрализующих антител.
- Доклиническая значимость: поддержка оценки кандидатов в вакцины путем раскрытия молекулярных механизмов проникновения вируса и уклонения от иммунного ответа.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот метод вписывается в непрерывный процесс разработки — от валидации мишени через оптимизацию соединений-лидеров к доклинической оценке, что особенно актуально для разработки вакцин и терапевтических средств на основе структурного анализа.
- Открытия в биологии: позволяет проверять гипотезы о механизмах проникновения вирусов и конформационной динамике поверхностного спайкового белка.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных структурных данных, позволяющих сравнивать состояния гликопротеинов при различных условиях (например, в связанном с лигандом и несвязанном состояниях).
- Аналитика: предоставляет возможности усреднения и классификации субтомограмм, что повышает соотношение сигнал/шум и позволяет выявлять гетерогенные популяции.
- Трансляционные исследования: связывает структурные данные с функциональными результатами в анализах на нейтрализацию и в моделях на животных.
- Корпоративное повторное использование: задействует удаленную вычислительную обработку через кластер Biowulf, обеспечивая масштабируемый совместный структурный анализ между группами исследователей и институтами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает структурное разрешение гликопротеинов оболочки ВИЧ, близкое к нативному, что снижает неопределенность в интерпретации механизмов.
- Практическая ценность: устанавливает воспроизводимые рабочие процессы для подготовки витрифицированных образцов, сбора данных и 3D-обработки.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности разработки вакцин путем определения структурных коррелятов нейтрализации.
- Влияние на портфель разработок: позволяет проводить приоритизацию кандидатов в иммуногены с учетом рисков на основе структурного соответствия нативному спайку.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области криоэлектронной микроскопии, витрификации образцов и трехмерной обработки изображений.
- Зависит от наличия доступа к оборудованию для крио-ПЭМ и вычислительным кластерам для усреднения субтомограмм.
- Необходима стандартизация протоколов подготовки сеток и сбора данных для всех пользователей и центров.
- Требует учета особенностей адаптации при применении метода к невирусным или реконструированным системам мембранных белков.
- Ограничено внутренним конформационным разнообразием и гетерогенностью гликопротеинов оболочки, что может потребовать тщательного усреднения частиц для достижения надежного разрешения.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Prepare Vitrified Virus Sample
2:39
Loading Samples into the Transmission Electron Microscope
3:37
Acquiring Cryo-electron Microscopy Data
4:52
Converting Microscopy Data into Structural Information that can be Visualized
6:19
Representative Results and Conclusion
