Количественная Частота опухолей, распространяющихся ячеек с использованием Ограничение трансплантации Разбавление сотовый в сингенных данио рерио

Метод трансплантации в условиях лимитирующего разведения является золотым стандартом оценки потенциала самообновления в экспериментальных моделях животных. В данной демонстрации в сингенеальные эмбрионы данио-рерио на стадии одной клетки вводят rag2 MIC и RAG2 GFP для создания трансгенных рыб, у которых разовьется флуоресцентно-маркированный острый лимфобластный лейкоз T-клеток. К 60-му дню жизни первичные лейкозные клетки выделяют из данио-рерио и затем очищают с помощью метода сортировки клеток с помощью флуоресценции (FACS).

Затем клетки пересаживают в предельном разведении в брюшную полость взрослых особей zebrafish, и в течение периода до 90 дней следят за ростом опухолей у рыб. Наконец, используется статистическая программная система для анализа предельного разведения, чтобы количественно определить частоту лейкозных клеток-предшественников в исходной опухоли. Анализ трансплантации клеток в предельном разведении позволяет исследователям точно оценить количество самообновляющихся клеток в общей массе опухоли.

Именно эти самообновляющиеся клетки способствуют формированию рака и в конечном итоге становятся причиной рецидива. Основным преимуществом проведения анализа трансплантации с лимитирующим разведением на модели данио-рерио является возможность трансплантации большого количества рыб в каждом эксперименте, что обеспечивает более высокую точность при определении частоты самообновляющихся опухолевых пролиферирующих клеток. Данный метод позволяет изучить опухолевые пролиферирующие клетки при остром лимфобластном лейкозе T-клеточного типа.

Данный метод также может быть применен для изучения других моделей рака у zebrafish. Джессика Блэкберн, научный сотрудник лаборатории, и Салли Лю, квалифицированный техник, продемонстрируют вам эту процедуру сегодня. Чтобы линеаризировать конструкции Rag2 CM и RAG2-GFP-DNA, переварите 10 µg каждой плазмиды с помощью рестриктазы NotI при 37 °C в течение ночи. После экстракции смесью фенол-хлороформ и осаждения этанолом каждую плазмиду суспендируют в 20 µL воды.

Определите концентрацию ДНК на 1% агарозном геле, выполнив разведения каждой переваренной плазмиды в пропорциях 1:1, 1:5 и 1:10, используя 20 мкл, 10 мкл и 5 мкл маркера молекулярного веса ДНК широкого диапазона. Затем разведите ДНК до конечной концентрации 60 нг/мкл для инъекции в штамм CG1 syngen. В эмбрионы zebrafish введите 250 нл rag2 CM в концентрации 30 нг/мкл и 30 нг/мкл.

Аккуратно введите две конструкции GFP в эмбрионы данио-рерио на стадии одной клетки, направляя ДНК непосредственно в клетку, а не в желток. Храните инъецированные эмбрионы при температуре 28.5 °C и удалите погибшие эмбрионы через 24 часа. Через пять дней жизни перенесите животных в большие аквариумы приблизительно через 28 дней после инъекции. Анестезируйте личинок данио-рерио, добавив 200 µL трикаина в концентрации 4 ng/mL к 25 mL системной воды для рыб в чашке Петри.

Осмотрите личинок на предмет развития флуоресцентно меченных TALL, используя эпифлуоресцентный микроскоп для обнаружения флуоресценции GFP. Отделите личинок с положительным результатом на наличие опухоли от отрицательных, чтобы исключить пропуск лейкемических особей при анализе. Личинок с отрицательным результатом можно исследовать на более позднем этапе, когда опухоли могут вырасти до больших размеров. Наблюдайте за флуоресцентно меченными лейкемическими рыбками не реже одного раза в неделю с помощью эпифлуоресцентного микроскопа для отслеживания роста опухоли.

Когда GFP-положительные лейкозные клетки захватывают более 50% организма животного, добавьте один миллилитр раствора Trica S в концентрации four nanograms per milliliter в чашку Петри, содержащую девять миллилитров системной воды для рыб, чтобы усыпить рыбу. Поместите рыбу в новую чашку Петри, содержащую один миллилитр 5% fetal bovine serum в 0.9 XPBS; измельчите рыбу лезвием бритвы, затем переносите смесь пипеткой для диссоциации крупных клеточных конгломератов. После этого пропустите клетки через сито с ячеями 40 micrometer в пробирку объемом 50 milliliter.

Перенесите 500 µL клеток в полистирольную пробирку объемом 4 мл. Добавьте 1 µL иодида пропидия в концентрации 1 mg/mL для маркировки погибших клеток, перемешайте на вортексе, затем поместите клетки на лед. Также подготовьте одну рыбу дикого типа CG для сбора нормальных клеток крови, которые будут служить носителем для опухолевых клеток при трансплантации: добавьте 4 мл 5% FPS в 0,9 X PBS в пробирку объемом 50 мл, чтобы общий объем составил 5 мл.

Подсчитайте количество нормальных клеток крови, разведите их до концентрации 3 × 10⁵ клеток/мл в 5% FBS в 0,9x PBS, затем с помощью пипетки внесите по 100 µL в каждую лунку 96-луночного планшета. Используя сортер клеток с флуоресцентной активацией (FACS), отсортируйте GFP-положительные PI-отрицательные опухолевые клетки в лунки 96-луночного планшета с клетками крови в указанных дозах. Кроме того, отсортируйте 10 000 клеток в лунку без нормальных клеток крови и проведите повторный анализ с помощью FACS для оценки чистоты и жизнеспособности отсортированных клеток. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 2000 ×g в течение 10 минут для осаждения клеток.

Удалите 95 µL супернатанта и ресуспендируйте клетки в оставшихся пяти µL. Введите клеточную суспензию в брюшную полость взрослых сингенных zebrafish в возрасте более 60 дней, используя микрошприц с иглой калибра 26,5. Перед трансплантацией анестезировать zebrafish не требуется.

Пересадите 10 лейкозных клеток 45 рыбам, 100 клеток — 20 рыбам, 1000 клеток — семи рыбам и 10 000 клеток TALL — пяти рыбам. Приблизительно через 28 дней после трансплантации исследуйте рыб-реципиентов (зебрафишей) с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, используя фильтр с длиной волны возбуждения 485/20 и эмиссионный фильтр 530/25 для детектирования флуоресценции GFP.

Запишите количество положительных результатов у рыб по отношению к общему числу инъецированных рыб. Повторно обследуйте рыб каждые 14 дней в течение периода до 90 дней и фиксируйте количество положительных результатов. В случае увеличения числа рыб с опухолями.

Проведите эвтаназию животного путем передозировки трихлорэтилена, внесите результаты в таблицу и загрузите данные в веб-программу для анализа метода предельного разведения с целью определения частоты самообновляющихся лейкемических клеток в первичном штамме TALL CG one. Эмбрионы были инъецированы RAG two cmic, а личинки RAG two GFP были проскринированы на наличие первичного TALL. Через 28 дней, в соответствии с предыдущими работами, примерно у 5% инъецированных рыб в тимусе обнаруживаются GFP-положительные T-клетки, и у 100% таких рыб развивается лейкемия. В данном случае флуоресцентно меченные клетки TALL были выделены методом сортинга из больных животных в возрасте 65 дней и использованы в анализе трансплантации клеток методом предельного разведения. Сначала был проведен гейт для отбора одиночных клеток.

Затем были выбраны клетки, отрицательные по пропидийиодиду. В завершение был установлен гейт для выделения только GFP-положительных лейкозных клеток для сортировки. В данном примере с рыбами, которым был трансплантирован TALL, на 28-й день опухоли на ранней стадии наблюдались в виде области GFP-положительных клеток рядом с местом инъекции.

Хотя в некоторых случаях TLS были более развиты и расширились, заполнив всю брюшную полость в ходе этих экспериментов, трансплантация была проведена более чем 220 животным, что один человек может легко выполнить за несколько часов. Анализ данных с использованием программного обеспечения elda показал, что в среднем одна из 135 T всех клеток являлась самообновляющейся лейкозной пролиферирующей клеткой. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как пересаживать опухолевые клетки в предельном разведении в брюшную полость сингенных рыб данио-рерио, а также как использовать полученные данные для определения частоты пролиферирующих опухолевых клеток в данной опухоли.

Дальнейшие исследования с использованием генетически модифицированных животных могут помочь выявить механизмы, регулирующие самообновление этих опухолевых клеток-прогениторов.