Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

Общая цель следующего эксперимента заключается в идентификации предшественников эритроцитов непосредственно в свежезаготовленной ткани мышей. Это позволяет изучать их молекулярные свойства в периоды, когда эритропоэтическая система этих мышей претерпевает изменения. Например, при эмбриональном развитии или в ответ на гипоксический стресс сначала изолируют гемопоэтическую ткань из плодной печени, селезенки или костного мозга взрослых мышей и подвергают её диссоциации до получения суспензии одиночных клеток.

Затем клетки маркируют антителами к поверхностным клеточным маркерам CD 71 и TER 1.19, а также любыми другими интересующими маркерами, например, для оценки выживаемости клеток или состояния клеточного цикла. Затем маркированную суспензию клеток анализируют с помощью проточного цитометра и идентифицируют специфические подгруппы эритробластов на разных стадиях созревания. Эти специфические подгруппы могут быть очищены путем сортинга клеток. Впоследствии для каждой подгруппы созревающих эритробластов может быть проведен клеточный и молекулярный анализ.

Возможность идентификации эритробластов на определенных стадиях созревания непосредственно в свежевыделенных гемопоэтических тканях дает нам возможность изучать клетки в физиологической коре. Таким образом, данный метод позволяет изучать реакцию эритробластов различных стадий созревания in vivo. При воздействии стимулов на мышей скорость эритропоэза ускоряется.

Например, условия гипоксии, имитирующие пребывание на большой высоте, или инъекции гормона эритропоэтина. Мы используем многопараметрическую проточную цитометрию для идентификации бластов в сложной тканевой среде и одновременного изучения их сигнальных путей выживания и статуса клеточного цикла. Мы также можем проводить сортировку эритробластов на конкретных стадиях созревания непосредственно из свежей ткани и исследовать уровни экспрессии их генов, состояние хроматина или другие молекулярные функции.

Дефинитивный эритропоэз у мышей происходит в селезенке и костном мозге взрослых особей. Таким образом, данные ткани будут извлечены из эвтаназированной мыши. После эвтаназии мыши возьмите кровь путем пункции сердца в пробирки для сбора крови с ЭДТА или гепарином; эта кровь будет использована позже для определения гематокрита, подсчета ретикулоцитов или общего анализа крови.

Поместите извлеченную селезенку и бедренную кость в отдельные пробирки с холодным буфером для окрашивания. При необходимости держите извлеченные ткани на льду. Взвесьте селезенку.

У мышей, находящихся в состоянии эритропоэтического стресса, вероятно, будет наблюдаться значительное увеличение массы селезенки. Впоследствии из полученных тканей подготавливают клетки селезенки и костного мозга по процедурам, описанным ранее для эмбрионов мыши. Определенный эритропоэз происходит в печени плода в период между 12,5 и 15,5 эмбриональными днями.

Беременные самки мышей с установленным сроком беременности подготавливают для получения клеток фетальной печени на 12,5–14,5 дни беременности. Беременных самок мышей усыпляют, и рога матки извлекают в чашку Петри со льдом. Используют холодную культуральную среду или буфер для окрашивания.

Для препарирования плода из матки на embryonic day 12.5 или более ранних стадиях развития, а также для последующего выделения печени плода, требуется диссекционный микроскоп. Сначала отделите каждый плод от рога матки. Затем аккуратно иссеките стенку матки, чтобы извлечь эмбрион, находящийся в амниотическом пузыре.

Осторожно снимите амниотическую оболочку. Печень плода представляет собой самую большую красную ткань в брюшной полости, расположенную под значительно меньшим по размеру сердцем. Чтобы извлечь печень плода, используйте пинцет для иммобилизации эмбриона по обе стороны от печени и аккуратно вытолкните печень из брюшной полости в среду.

Осторожно перенесите печень в пробирку со свежим буфером для окрашивания. После того как все эмбриональные печени будут вырезаны и перенесены в пробирки со свежим буфером для окрашивания, механически диссоциируйте ткани печени путем пипетирования, затем профильтруйте диссоциированные клетки через нейлоновый сетчатый фильтр с размером пор 40 мкм, промойте клетки дважды путем центрифугирования, удаляя супернатант и повторно суспендируя осадок в буфере для окрашивания.

После второй промывки окрасьте клетки трипановым синим и подсчитайте их с помощью гемоцитометра. Печень эмбриона на стадии E 13.5 содержит около 10⁷ клеток. Ресуспендируйте клетки в концентрации от 1 до 2 × 10⁶ клеток на 200 µL образца для проведения проточного цитометрического анализа.

Для целей данного видеопротокола окрашивание антителами для проточной цитометрии будет продемонстрировано только на клетках плодного печени. Для начала этой процедуры приготовьте премикс для окрашивания первичными антителами, содержащий следующее: очищенный кроличий IgG для блокирования FC-рецепторов в клетках мыши, CD 71 FETR one 19 PE и антитела к поверхностному белку клеток fast. Осторожно перемешайте раствор антител, перевернув пробирку два-три раза; добавьте 200 µL премикса для окрашивания первичными антителами к предварительно подготовленному образцу клеток плодного печени и осторожно перемешайте содержимое пипетированием вверх-вниз для ресуспендирования клеток.

Затем подготовьте эти шесть контрольных образцов клеток. Неокрашенный образец, в котором клетки остаются в буфере для окрашивания для определения фоновой автофлуоресценции клеток; одноцветный контроль для каждого антитела или красителя, используемого в протоколе, для коррекции спектрального перекрытия между каналами, которыми в данном эксперименте являются TUR one 19 PE CD 71 fz fast, биотин и стрептавидин A PC; и контроль «флуоресценция минус один» (FMO) для fast biotin, который обеспечивает истинный фон для этого канала, где клетки окрашены всеми цветами или антителами, предусмотренными протоколом, за исключением fast biotin. Инкубируйте образец и соответствующие контроли с первичными антителами на льду в течение 45 минут — 1 часа в темноте.

По окончании инкубации промойте клетки, добавив три миллилитра буфера для окрашивания в каждую пробирку с образцом, и центрифугируйте в течение трех-пяти минут при ускорении примерно 400 ×g при температуре four degrees celsius. Затем добавьте strep avid в PC и инкубируйте пробирки на льду в течение 30–45 минут. По завершении инкубации промойте клетки так же, как при окрашивании первыми антителами.

Наконец, ресуспендируйте клетки в окрашивающем растворе, содержащем непроникающий в клетку краситель ДНК seven a a d для исключения погибших клеток. Теперь образцы готовы для анализа методом проточной цитометрии. Наиболее сложным аспектом данной процедуры является правильный анализ гейтирования событий проточной цитометрии, позволяющий достоверно идентифицировать субпопуляции эритробластов.

Этот метод требует тщательной настройки прибора, использования всех необходимых контрольных образцов, точной компенсации спектрального перекрытия и последующего гейтирования для исключения мертвых клеток, агрегатов и очень мелких событий. В начале анализа данных неокрашенный образец и контрольные образцы с одним красителем используются для настройки компенсации спектрального перекрытия для каждой комбинации цветов.

В данном примере мы продемонстрируем, как флуоресценция FITC проникает в канал PE и как этот спектральный перехлест корректируется после компенсации. Сначала, используя неокрашенный контроль, мы определяем область, положительную по FITC и отрицательную по PE. Затем, используя одноцветный контроль FITC, мы можем визуализировать спектральный перехлест в канал PE.

После проведения цифровой компенсации с помощью программного обеспечения FlowJo сигнал перекрытия (spillover fit E) в канале PE минимизируется. После компенсации можно удалить мертвые клетки, агрегаты и мелкие события. Агрегаты и клеточные дуплеты удаляются путем построения графика высоты прямого светорассеяния (forward scatter height) относительно площади прямого светорассеяния (forward scatter area) и выбора событий, попадающих в узкий диагональный гейт.

Мертвые клетки удаляют путем отбора клеток, негативных по отношению к DAPI — мембран-непроницаемому красителю ДНК. Гейт жизнеспособных DAPI-негативных клеток также исключает очень мелкие события, такие как ядра или клеточный детрит, которые характеризуются очень низким прямым светорассеянием. Далее мы представим стратегию гейтирования для клеток плодного печени.

Свежесобранные клетки были окрашены CD 71 TUR one 19 и коктейлем антител, меченных ZI, направленных против маркеров неэритроидных линий. В данном примере образцы уже прошли компенсацию спектрального перекрытия, после чего было применено гейтирование для исключения агрегатов, мертвых клеток и слишком мелких событий. Мы используем образец FMO, содержащий все красители, кроме красителя для положительных по линии клеток, чтобы построить гистограмму fitzy и определить гейт для клеток, отрицательных по данной линии; затем мы применяем этот гейт к образцу клеток печени плода, окрашенному конъюгированными с ZI маркерами линий.

Клетки, негативные по маркерам линий (Lineage negative), отбирают и анализируют с помощью графиков, где по оси Y отложены CD 71 и TER 19. Теперь клетки на оси A готовы к разделению на подмножества от S0 до S5. Подмножество S0, обедненное по маркерам линий, в основном содержит клетки с потенциалом CFUE до наступления зависимости от EPO.

Подмножество S1 содержит EPO-зависимые CFUE-клетки, находящиеся преимущественно в S-фазе клеточного цикла. Клетки подмножества S2 утратили способность к образованию колоний и начинают экспрессировать гемоглобин. Клетки подмножества S3 представляют собой преимущественно базофильные эритробласты. Подмножества S4 и S5 содержат поздние эритробласты. Здесь представлена стратегия анализа после сбора данных от клеток селезенки, обработанных и маркированных антителами к CD 71 и TER 119, а также гистограмма рецептора смерти Fas.

На одной из них показаны все зарегистрированные события, где диагональный гейт представляет события, которые, вероятно, являются одиночными клетками, за исключением дуплетов или более крупных агрегатов. Клетки в этом гейте далее анализируются на второй гистограмме. Очень мелкие события, вероятно, представляющие собой ядра или клеточный детрит, исключаются.

Отсеянные клетки показаны на гистограмме три, где DAPI-положительные клетки, которые, вероятно, являются мембранопроницаемыми апоптотическими клетками, исключены из дальнейшего анализа. Гистограмма четыре показывает результирующую популяцию жизнеспособных клеток селезенки. Про-eGate содержит CD 71 high TER one 19 Intermediate клетки; клетки tur R one 19 high подвергаются дальнейшему анализу на гистограмме пять.

Здесь клетки с высокой экспрессией CD 71 подразделяются на менее зрелые клетки с большой площадью — эритробласты A и более мелкие, более зрелые эритробласты B. Наиболее зрелой подгруппой эритробластов является C. Экспрессию белков клеточной поверхности для каждой из этих подгрупп можно измерять одновременно, добавляя соответствующие антитела вместе с TER 19 и CD 71. На гистограмме окрашивания 6 показана экспрессия рецептора смерти Fas на клеточной поверхности, в частности в подгруппе A у мышей в базовом состоянии и у мышей, которым была введена однократная доза Epo.

Результаты указывают на то, что EPO подавляет быструю экспрессию в данной области. Также может быть измерена экспрессия внутриклеточных белков или статус клеточного цикла популяций in vivo для клеток каждого подмножества. В данном репрезентативном анализе клеточного цикла мышам вводили BRDU внутрибрюшинно, после чего через 30–60 минут производили забор костного мозга.

Помимо окрашивания на CD 71 и TER one 19, клетки были окрашены на включение BRDU в их реплицирующуюся ДНК; BRDU-положительные клетки находятся в S-фазе цикла. Интерфазные клетки являются BRDU-отрицательными и могут быть разделены на фазы G one или G two M. Используя DNAD семь A A D, клетки могут быть отсортированы из каждой из подгрупп PRO E area A A B и A EC.

Здесь они представлены в препаратах цитозина, демонстрирующих последовательное созревание, которое сопровождается уменьшением размера клеток, конденсацией ядер и усилением коричневого окрашивания, что отражает экспрессию гемоглобина. Наконец, здесь представлен репрезентативный анализ клеточного цикла подмножества S3 в эмбриональной печени на стадии E 13.5. Беременным мышам вводили BrdU.

Печень плодов извлекали через 30–60 минут, после чего фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали антителами к CD 71, TER 1-19 и BRDU. Анализировали статус клеточного цикла клеток S3, где клетки S-фазы определяют по наличию BRDU, а содержание ДНК количественно оценивают с помощью окрашивания красителем ДНК 7-AAD.

Описанный нами цитометрический подход позволяет одновременно исследовать такие клеточные функции, как экспрессия маркеров клеточной поверхности и других белков, выживаемость клеток, клеточная сигнализация с использованием фосфоспецифических антител и статус клеточного цикла. Таким образом, этот метод позволяет нам изучать молекулярные ответы эритробластов — клеток на определенной стадии созревания — на широкий спектр стимулов или эффект генетических мутаций. Следует отметить, что субпопуляции по стадиям созревания при проточной цитометрии определяются на основе экспрессии маркеров клеточной поверхности и прямого светорассеяния.

Мы обнаружили, что в целом клетки в каждом подмножестве соответствуют схожим морфологическим стадиям эритробласта в широком спектре моделей мышей. Тем не менее, мы рекомендуем проверять это при изучении новой модели мыши. Клетки из каждого подмножества могут быть отсортированы для анализа РНК или транскриптома с последующим изучением их морфологии; в экспериментах по сортировке следует использовать низкое давление сортировки и широкие сопла, чтобы минимизировать напряжение сдвига, воздействующее на клетки.

Мы также рекомендуем проверять чистоту и жизнеспособность клеток после каждого эксперимента по сортировке. Наконец, при обнаружении изменения частоты определенного подмножества важно установить, вызвано ли это истинным изменением количества клеток в данном подмножестве или изменениями в других подмножествах. Поэтому, помимо измерения частоты подмножеств, всегда необходимо измерять абсолютное количество клеток в каждом подмножестве.