Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация
1 августа 2011 г.
В естественных условиях Метод для тестирования функции генов в послеродовом мозга описывается. Рекомбинантный AAVs выражения Cre и / или флуоресцентного белка вводят в мозг новорожденных мышей. Мозаика инактивации гена и редкие нейронов маркировки будут достигнуты, позволяя быстрый анализ функции генов в процессах решающее значение для развития нервной цепи.
Общая цель данной процедуры — манипулирование функцией генов в постнатальный период развития мозга. Это достигается путем предварительного отбора и подготовки подходящих вирусов, их загрузки в шприц и подготовки оборудования для инъекций. Затем вирус вводится в мозг новорожденных мышат, после чего на заключительном этапе животные подвергаются эвтаназии для получения изображений инъецированных областей.
В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие дифференциальное мечение контрольных клеток и клеток с нокаутом с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронаук, например, о том, как генетически регулируется период постнатального развития. Для инъекции можно использовать коммерчески доступный раствор аденоассоциированного вируса с полным титром, обычно 10¹² геномных копий на мл, для воздействия на большое количество клеток.
Если требуется низкая плотность или маркировка, начните с разведения 1:10. После размораживания вируса на льду немедленно перенесите объем для предварительного разведения в стерильную ПЦР-пробирку объемом 250 мкл. Держите разведение на льду.
Подготовьте инъекционный насос, выбрав подходящий шприц и подключив его к игле для загрузки. Затем осторожно наберите вирусный раствор до появления в шприце очень маленького пузырька воздуха; для облегчения этого этапа можно использовать инертный краситель для загрузки. Теперь закрепите шприц в насосе с помощью фиксатора.
Затем аккуратно подсоедините соединительную трубку между шприцем и держателем иглы. Убедитесь, что инъекционная игла находится в прямом контакте с соединительной трубкой внутри держателя иглы. Теперь медленно перемещайте раствор через соединительную трубку до тех пор, пока на кончике иглы не появится маленькая капля раствора.
Осторожно закрепите плунжер рядом с блоком толкателя с помощью кронштейна на насосе. Установите скорость введения на 8 µL/мин, а объем введения — в диапазоне от 1 до 2 µL. Затем настройте параметр диаметра шприца в настройках насоса в соответствии с диаметром используемого вами шприца.
Наконец, чтобы защитить щенков в фазе восстановления, установите температуру нагревательной пластины на 38 °C и накройте ее бумажным полотенцем. Используя протокол, одобренный IACUC, подготовьте щенков мышей P0 или P1 к инъекции, подвергнув их холодной анестезии. Слегка смочите несколько бумажных полотенец водой и поместите их на лед.
Затем поместите четырех или пяти щенков на бумажные полотенца так, чтобы они были хорошо разделены. Осторожно накройте щенков бумажными полотенцами, положите сверху небольшое количество дробленого льда и выдержите щенков в таком состоянии около пяти минут. Щенков можно безопасно держать на льду до 15 минут без вреда для их последующего восстановления.
Теперь поместите анестезированного детеныша на монтажный блок для обеспечения наилучшего доступа к месту инъекции. Например, доступ к коре головного мозга проще всего обеспечить, уложив животное на живот. Детеныша можно зафиксировать с помощью пластыря; вручную стабилизируйте голову детеныша и натяните кожу, чтобы предотвратить его смещение.
Затем найдите анатомические ориентиры черепа, такие как лямбда-шов, и выберите воспроизводимую точку инъекции; другой рукой аккуратно введите иглу через череп. Не давите сильно, если игла не проникает в череп легко. Вместо этого измените положение иглы и осторожно попробуйте снова.
Глубина инъекции в кору головного мозга немного варьируется в зависимости от конкретного животного и линии; обычно подходит глубина от 0,5 до 1 мм. Теперь введите вирусный раствор, попросив коллегу активировать насос, чтобы свести к минимуму движения руки. В идеале для запуска насоса после инъекции можно использовать ножную педаль.
Оставьте иглу на месте на несколько секунд, затем, удерживая голову щенка неподвижно, плавно извлеките иглу. Теперь дайте щенку восстановиться в течение 5–10 минут на закрытой подогревочной платформе.
В течение этого времени продолжайте вводить препарат остальным щенкам. Когда все щенки снова станут розовыми и начнут двигаться, осторожно протрите их частью их подстилки из гнезда. Только после этого их можно возвращать к матери.
В противном случае они могут быть восприняты как чужие детеныши, которых мать, скорее всего, убьет после того, как они будут ей возвращены. Очистите систему для инъекций, полностью заполнив шприц ацетоном или 70% ethanol. Если используются чувствительные к ацетону компоненты, такие как sano, acurate или адгезивы, промойте систему несколько раз, каждый раз используя свежий раствор.
Это позволит удалить остатки вирусного раствора и преципитаты растворителей, которые испарятся. После промывки установки продезинфицируйте рабочую зону отбеливателем, чтобы подготовить ее для следующего экспериментатора. Успешное выполнение техники обеспечивает интенсивное заражение нейронов в месте инъекции.
Инъекции в определенные области, такие как кора головного мозга и верхние холмики, обычно приводят к локальному инфицированию с минимальным распространением на соседние области. Использование вирусного раствора с высоким титром повышает вероятность инфицирования прилегающих зон, например гиппокампа, в то время как инъекция раствора с низким титром обычно приводит к разреженному инфицированию, преимущественно вблизи места введения, как при инъекции в срединную линию мозжечка; число инфицированных клеток должно коррелировать с титром вводимого вирусного раствора.
Например, введение в мозжечок смеси высокотитровых растворов двух вирусов AAV8, экспрессирующих разные флуоресцентные белки, приводит к инфицированию множества клеток Киджи, которые будут различаться по метке. И наоборот, введение раствора вируса с низким титром может привести к разреженному инфицированию, что облегчает визуализацию отдельных клеток. Флуоресцентно меченные нейроны можно наблюдать непосредственно в свежесрезанной живой ткани или подвергнуть иммуногистохимическому окрашиванию.
Это усиливает эндогенные флуоресцентные сигналы для последующего получения изображений с помощью широкопольной или конфокальной флуоресцентной микроскопии. Наконец, RAAV eight способен инфицировать различные типы нейронов в коре с интенсивным мечением тонких отростков. После освоения эта процедура занимает примерно 30 минут при условии правильного выполнения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод in vivo для исследования функции генов в процессе постнатального развития мозга с использованием рекомбинантных AAV. Путем инъекции этих вирусов в мозг новорожденных мышей исследователи могут добиться мозаичной инактивации генов и разреженного мечения нейронов, что облегчает анализ функции генов в развитии нейронных цепей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Функции генов
- Развитие нейронных цепей
Теоретические сведения
- Понимание функций генов в процессе постнатального развития мозга имеет решающее значение.
- Рекомбинантные AAV могут быть использованы для манипулирования экспрессией генов.
- Данный метод позволяет изучать генетическую регуляцию в критические периоды развития.
- Иммунофлуоресцентная микроскопия позволяет дифференцировать контрольные клетки и клетки с нокаутом.
Цель исследования
- Для манипулирования функцией генов в постнатальный период развития мозга.
- Для исследования того, как генетические факторы регулируют постнатальное развитие нервной системы.
- Для получения данных о механизмах, лежащих в основе формирования нейронных цепей.
Используемые методы
- Подбор и подготовка соответствующих рекомбинантных AAV.
- Инъекция вирусов в мозг новорожденных мышат.
- Иммунофлуоресцентная микроскопия для визуализации зон инъекции.
- Анализ дифференциального мечения контрольных клеток и клеток с нокаутом.
Основные результаты
- Успешно осуществлены инактивация гена и маркировка нейронов.
- Результаты демонстрируют генетическую регуляцию постнатального развития.
- Метод создает основу для будущих нейробиологических исследований.
- Полученные данные могут расширить понимание динамики нейронных цепей.
Выводы
- Данный метод эффективен для изучения функций генов в развивающемся мозге.
- Полученные результаты способствуют пониманию развития нейронных цепей.
- Будущие исследования могут опираться на этот подход для изучения генетического влияния на поведение.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает быстрый и масштабируемый анализ функций генов в процессе постнатального развития мозга, восполняя критический пробел в валидации мишеней для нарушений нейропсихического развития. Позволяя обойти ограничения, связанные с эмбриональной летальностью, этот подход способствует механистическому снижению рисков при выборе терапевтических мишеней в путях, значимых для аутизма и шизофрении. Метод повышает прогностическую достоверность выбора мишеней, связывая генетические пертурбации с фенотипами на уровне нейронных сетей в физиологически релевантной системе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию генов в постнатальных нейронных цепях, в которых проявляется действие многих генов, связанных с нарушениями нейроразвития.
- Практическая ценность: обеспечивает мозаичную инактивацию генов и разреженное мечение в течение нескольких дней, что позволяет избежать многомесячного создания условных мышиных моделей.
- Научная ценность: поддерживает проведение клеточно-автономного функционального анализа генов, участвующих в росте аксонов, дендритном тайлинге и уточнении синаптических связей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет создавать количественно сопоставимые популяции контрольных клеток и клеток с нокаутом с помощью дифференциального флуоресцентного мечения для параллельного фенотипического анализа.
- Практическая ценность: позволяет титровать вирусную нагрузку для модуляции плотности инфицирования, обеспечивая масштабируемое разреженное или плотное мечение в зависимости от требований последующих анализов.
- Научная ценность: совместимость с методами иммунофлуоресценции и электрофизиологии облегчает мультимодальную валидацию взаимодействия с мишенью и влияния на нейронные цепи.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует постнатальные генетические нарушения у мышей и крыс, что соответствует срокам развития нейропсихиатрических расстройств у человека.
- Практическая ценность: Возможность применения лентивирусной доставки и конструкций shRNA/доминантно-негативных белков расширяет инструментарий модуляции мишеней для доклинической валидации.
- Научная ценность: Позволяет изучать функцию генов в таких критических процессах, как формирование синапсов, что имеет прямое отношение к патофизиологическим механизмам психических расстройств.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы ранних этапов поиска лекарственных средств, поддерживая валидацию мишеней и идентификацию ведущих соединений путем предоставления причинно-следственных генетических доказательств в постнатальных нейронных цепях перед проведением скрининга соединений.
- Открытийная биология: проверка терапевтических гипотез путем делеции генов-кандидатов в определенных областях мозга для оценки фенотипических последствий для созревания нейронных цепей.
- Скрининг: получение стандартизированных, воспроизводимых нейрональных препаратов с внутренним контролем (маркированные и немаркированные клетки) для надежного измерения эффекта соединений.
- Аналитика: получение количественных данных визуализации и электрофизиологических показателей, позволяющих проводить статистическое сравнение генотипов и условий терапии.
- Трансляционные исследования: установление связи между генетическими манипуляциями и результатами на уровне нейронных цепей, что способствует доклинической валидации модуляции мишеней с опорой на биомаркеры.
- Корпоративное повторное использование: создание многократно используемой платформы вирусной доставки, применимой для множества генных мишеней и областей мозга, что сокращает затраты на избыточную разработку моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность при валидации мишени, связывая постнатальную потерю гена со специфическими фенотипами нейронных цепей.
- Операционная ценность: Стандартизирует пертурбацию генов посредством вирусной доставки, повышая воспроизводимость результатов в разных лабораториях и исследованиях.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет быстрого установления генетической причинно-следственной связи в релевантных для заболевания постнатальных периодах.
- Влияние на портфель: Снижает риски при продвижении мишени, предоставляя функциональные доказательства в системах, моделирующих сроки нейроразвития человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с новорожденными мышами, навыками стереотаксических инъекций и знание протоколов биологической безопасности при работе с вирусами.
- Зависит от наличия очищенных рекомбинантных AAV- или лентивирусных векторов, а также инфраструктуры для флуоресцентной микроскопии.
- Необходима стандартизация вирусного титра, объема инъекций и процедур анестезии для обеспечения согласованности результатов между исследованиями.
- Адаптация метода для различных областей мозга или других видов может потребовать оптимизации координат инъекций и тропности вирусных серотипов.
- Практическое ограничение: эффективность зависит от активности Cre-рекомбиназы и наличия flox-аллелей, что может варьироваться в зависимости от мишени.
