Частица Агглютинация Метод Полиовирус Идентификация

Общая цель следующей процедуры заключается в быстрой идентификации изолятов полиовируса с помощью простого протокола. Для данного анализа используются сенсибилизированные желатиновые частицы, покрытые химерными молекулами, которые содержат внеклеточный домен рецептора полиовируса человека, соединенный с Fc-фрагментами IgG2. Поскольку эти частицы обладают равномерным сродством ко всем серотипам изолятов полиовируса, при инкубации с образцами, содержащими любой полиовирус человека, происходит агглютинация частиц.

Однако, если в образце присутствуют антитела, способные распознавать конкретный выделенный вирус, происходит нейтрализация, которая препятствует агглютинации. С использованием данной экспериментальной системы экспресс-идентификация изолятов полиовируса может быть выполнена в ходе одноэтапной реакции. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами, такими как традиционный тест на нейтрализацию, является простота процедуры и интерпретации, что позволяет снизить трудозатраты и сократить время получения результатов. Для восстановления антител к PV1, PV2 и PV3 добавьте по 0.5 milliliters воды в каждый флакон.

Затем перенесите каждый раствор антител в отдельные пробирки, содержащие 4,5 миллилитров поддерживающей среды. Некоторые партии антител к PV поставляются в реконструированном виде; для таких партий антител к PV добавление воды для реконструирования не требуется.

Затем в чистых промаркированных пробирках приготовьте смеси комбинированного раствора антител в соотношении один к одному с конечным объемом 3,6 milliliters. Например, смешайте 1,8 milliliters anti PV one с 1,8 milliliters anti PV two. Для приготовления комбинации anti PV one плюс PV two повторите эту процедуру для всех возможных попарных комбинаций, а также приготовьте раствор, содержащий все три типа антител, смешав по 1,2 milliliters каждой антисыворотки.

После приготовления четырех смесей добавьте по 720 µL FCS в каждый раствор антител. Это поможет снизить неспецифическую агглютинацию частиц желатина антителами в ходе анализа. Пулы антител можно хранить при температуре -20 °C до их использования в анализе на агглютинацию.

В данном анализе используются лиофилизированные частицы желатина, покрытые внеклеточными доменами человеческого рецептора полиовируса и FC-доменами мышиного IgG2. Для обеспечения стабильности картины агглютинации убедитесь, что в одном эксперименте используется одна и та же партия частиц, а не разные партии. Для восстановления частиц добавьте по 1,5 миллилитров буфера для восстановления в каждый флакон. Осторожно постучите по флакону для тщательного перемешивания.

Реконструированные частицы можно хранить при температуре 4 °C до двух недель. Сначала спланируйте эксперимент в 96-луночном микротитрационном планшете. Для каждого образца в лунке номер один должен находиться только вирус.

Лунки со второй по пятую будут содержать вирус и один из четырех смешанных растворов антител. Обязательно оставьте одну лунку для отрицательного контроля, содержащую только среду без вируса и антител. После подготовки планшета добавьте по 12 µL соответствующего раствора антител в каждую лунку со второй по пятую и 12 µL среды для роста.

Среду только с вирусом добавьте в лунки первого ряда, а в лунку с отрицательным контролем — в шестой ряд. Затем внесите по 12 µL образца вируса в первые пять рядов и 12 µL ростовой среды в лунку с отрицательным контролем в шестом ряду. После посева антител и вируса ресуспендируйте восстановленные частицы желатина, осторожно постучав по планшету, и немедленно добавьте по 25 µL частиц в каждую лунку.

Важно не допускать осаждения частиц перед их переносом на планшет, чтобы обеспечить равное количество частиц в каждой лунке. Поместите планшет для анализа на миксер для планшетов и перемешивайте в течение 30 секунд. Затем поместите планшет на лист белой бумаги и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов для обеспечения процесса агглютинации.

Важно не перемещать планшет во время или после инкубации, так как образовавшаяся агглютинация нестабильна. После завершения реакции сделайте несколько фотографий планшета, на которых будет отчетливо видно качество агглютинации в каждой лунке. В лунках, где агглютинация не произошла, как показано здесь слева, цветные частицы желатина осядут на дно; в лунках, где агглютинация произошла, они образуют осадок.

Благодаря взаимодействию между вирусом и частицами желатина, покрытыми IgG 2A к pvr, в центре наблюдается диффузный цветной рисунок. В данном эксперименте мы проверили способность вирусных растворов PV 1, 2 и 3 индуцировать агглютинацию в присутствии антител. При комбинациях, указанных здесь, в отсутствие вируса или антител агглютинация не происходит, и частицы желатина выпадают в осадок, в отличие от лунки, содержащей вирус, но не содержащей антител.

Агглютинация произошла вследствие взаимодействия вируса с покрытыми PVR IgG частицами желатина в экспериментальных лунках; при этом агглютинация вирусов предотвращается в любой лунке, содержащей антитела, которые специфически нейтрализуют данный вирус. Например, агглютинация полиовируса 1 типа предотвращается в лунках, содержащих антитела к PV1, но не в лунках, содержащих только антитела к PV2 и PV3.

То же самое относится к полиовирусам второго и третьего типов. При должном навыке эта процедура может занять всего три часа при условии её правильного выполнения.