С памятью формы полимеров для активного культуры клеток

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании клеток на субстрате с топографией, которая изменяется с течением времени. Это достигается путем первоначального программирования полимера с эффектом памяти формы в постоянную форму, которая может быть «запомнена». Затем полимер с эффектом памяти формы программируется в временную форму, на которую впоследствии высевают клетки.

Заключительным этапом процедуры является активация полимера с эффектом памяти формы для его возврата к исходному состоянию путем повышения температуры; в результате с помощью флуоресцентной микроскопии можно получить данные, демонстрирующие изменение поведения клеток. Здравствуйте, меня зовут Пэт Мазер. Я профессор биомедицинской и химической инженерии и директор Института биоматериалов Сиракьюса здесь, в Сиракьюсском университете.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с коммерческими или специализированными устройствами для растяжения клеток заключается в том, что в рамках одной полимерной системы мы можем подвергать клетки воздействию самых разнообразных сложных деформаций. Меня зовут Джей Хендерсон. Я доцент кафедры биомедицинской и химической инженерии и член Сиракьюсского института биоматериалов.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механобиологии, например, о том, как клетки реагируют на динамические изменения в своей физической среде. Меня зовут Кевин Дэвис, я аспирант кафедры биомедицинской и химической инженерии Сиракузского университета. Хотя этот метод позволяет получить представление о механической биологии в 2D, его также можно использовать для других систем, таких как 3D-каркасы с изменяемой формой для тканевой инженерии.

Перед началом данной процедуры подготовьте специальную камеру для отверждения, используя предметное стекло, тефлоновый спейсер толщиной 1 мм и алюминиевую пластину. Закрепите камеру с помощью маленьких биндер-клипов, затем введите NOA 63 в камеру через отверстие в тефлоновом спейсере, используя иглу 18 G. После этого поместите камеру на нагревательную плитку, установленную на 125 °C.

После нагрева камеры дайте ей прогреться до равномерной температуры в течение пяти минут. Произведите полимеризацию NOA 63 в течение 20 минут, расположив УФ-лампу на расстоянии 6,5 сантиметров от поверхности стекла. Извлеките NOA 63 из камеры, пока материал еще теплый, используя лезвие бритвы.

Затем подвергните полимер с эффектом памяти формы дополнительному отверждению под воздействием УФ-излучения в течение трех часов и 40 минут непосредственно на нагревательном планшере при 125 °C. Для характеристики эффекта памяти формы NOA 63 изготовьте образец в форме гантели путем горячего прессования отвержденной пленки с использованием специального пробойника. В завершение закрепите образец в динамическом механическом анализаторе с растяжным зажимом.

Переведите прибор в режим контроля усилия и запрограммируйте процедуру испытания в соответствии с письменным протоколом, прилагаемым к данному видео. Результатом процедуры является изотермически отвержденная полимерная пленка с эффектом памяти формы (SMP). Поместите CSMP на нагревательную плитку и установите температуру выше температуры стеклования, чтобы снизить модуль упругости и облегчить резку. Подготовьте отдельные образцы из изотермически отвержденной пленки SMP.

Отрежьте пленку s и p лезвием до нужного размера образца. Временную форму можно зафиксировать несколькими разными способами. В данном случае для создания временного рельефа методом тиснения используется настольный гидравлический пресс с плитами, которые могут нагреваться и охлаждаться.

Сначала установите температуру PLA выше значения tg. Для данной демонстрации был изготовлен штамп путем отверждения эпоксидной смолы на виниловой пластинке для создания временной формы с параллельными бороздками. Штамп может быть изготовлен из других материалов и иметь иную топографию, но он должен быть более жестким, чем NOA 63.

При температуре тиснения поместите образцы s и p лицевой стороной вниз на тиснение. Затем поместите образцы и тиснение в пресс. Приложите предварительную нагрузку примерно 100 kilo pascals для обеспечения контакта между нагревательными PLA и образцами; выдержите около пяти минут, чтобы образцы достигли равномерной температуры.

После достижения равномерной температуры приложите к образцам давление от одного до шести мегапаскалей и выдержите в течение одной минуты. SMP подвергнется разлому. Если приложить большее напряжение.

Приложите меньшие нагрузки для создания топографии с меньшей амплитудой. После приложения давления снизьте температуру до значения ниже TG, используя систему водяного охлаждения плит пресса. Когда температура упадет ниже tg, снимите приложенную силу перед началом эксперимента по активному культивированию клеток.

УФ-излучение в шкафу биологической безопасности используется для стерилизации образцов. Разместите образцы лицевой стороной вниз в стерильных чашках без крышек и включите УФ-лампу на шесть часов. Затем переложите образцы в новые стерильные чашки лицевой стороной вверх.

Оставьте включенным УФ-излучение еще на шесть часов. Перед посевом клеток образцы должны достичь относительно стабильного состояния равновесия. Поместите образцы в 96-луночный планшет и добавьте 150 µL полной ростовой среды.

Среды на лунку. Поместите планшет в инкубатор при 30 °C с 5% CO2 до достижения желаемой степени частичного восстановления. В данной демонстрации образцы инкубируют в течение 30 часов для создания амплитуды, достаточной для выравнивания клеток.

После достижения частичного восстановления образцы можно высеять с клетками. Поместите образцы в новый 96-луночный планшет. Затем добавьте по 150 microliters клеточного раствора в каждый из этих образцов, C3 H 10 t и половину.

Большинство эмбриональных фибробластов используют в концентрации 20 000 клеток на миллилитр. Чтобы получить изолированные клетки, дайте им прикрепиться и распластаться на временном рельефе, инкубируя при 30 °C в течение 9,5 часов. Затем, перед переходом, оцените морфологию клеток, отобрав образцы, проведя их окрашивание и флуоресцентную визуализацию.

Этот материал проявляет автофлуоресценцию в большинстве УФ и видимого диапазонов; для снижения фона рекомендуется использовать флуорофоры в дальней красной области спектра, такие как Alexa Fluor 647. Чтобы образцы восстановились, перенесите планшет в инкубатор при 37 °C и продолжите культивирование в течение 19 часов. Это позволит материалу стабилизироваться, а клеткам — адаптировать свою морфологию к новой топографии. После инкубации нанесите соответствующие красители, например, фаллоидин для визуализации филаментозного актина.

В качестве заключительного этапа можно выполнить визуализацию клеток на новой топографии; здесь показан односторонний эффект памяти формы основного объема одного отвержденного образца NOA 63. Процедура была повторена трижды, где звездочкой отмечено начало экспериментального отверждения. NOA 63 представляет собой прозрачное стеклообразное твердое вещество, обладающее отличными свойствами памяти формы.

В данном случае материал был отвержден и демонстрирует однородную температуру стеклования TG, равную 51.1 °C, определенную по началу снижения модуля сжатия. Снижение деформации, наблюдаемое здесь, происходит при измеренном tg. Значительная часть приложенной деформации 4.7% зафиксировалась после снятия нагрузки при 20 °C, что соответствует коэффициенту фиксации 89.3%. Затем зафиксированная деформация восстановилась с коэффициентом 84.4% в относительно узком температурном диапазоне при нагревании.

Характеристики памяти формы не ухудшились в течение трех циклов, о чем свидетельствует тот факт, что все кривые проходят практически по одному и тому же пути. Амплитуда временного рельефа уменьшается со временем при 30 °C в течение 30 часов. При 30 °C.

Амплитуда была снижена примерно на 50%, что указано здесь для нулевого момента времени. В течение следующих 9,5 часов она снижается еще на 10%. При инициировании восстановления путем повышения температуры до 37 °C амплитуда снижается до 0,5% от начальной амплитуды в течение 9,5 часов для использованного тиснера и напряжения тиснения 4,9 megapascals.

Это соответствует функциональному изменению структуры от борозд размером 13 мкм до почти плоской поверхности. Данный полимер восстанавливается в температурном диапазоне от 30 до 37 °C в условиях культивирования клеток. Это происходит за счет поглощения воды из культуральной среды; вода пластифицирует полимер, что снижает tg, обеспечивая восстановление при температурах ниже температуры стеклования сухого полимера, составляющей 51 °C.

Примером поведения клеток, контролируемого с помощью активных субстратов для культивирования, является изменение организации цитоскелета на временных рифленых субстратах. До запуска восстановления актиновые микрофиламенты выстраиваются вдоль направления борозд. После восстановления путем повышения температуры микрофиламенты реорганизуются и ориентируются хаотично.

Напротив, контрольные образцы со статической плоской поверхностью или статическими бороздками не подвергаются реорганизации после повышения температуры. При выполнении данной процедуры важно помнить, что геометрия камеры отверждения, температура стеклования полимера, метод фиксации деформации и состав самого полимера могут быть скорректированы для достижения перехода, необходимого в вашем конкретном эксперименте при следовании данной методике. Другие методы, такие как ПЦР в реальном времени, могут быть использованы для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о том, как изменяется экспрессия генов в ответ на механическую стимуляцию со стороны субстрата после его разработки.

Эта методика открыла исследователям в области механобиологии клетки возможность изучать перестройку цитоскелета и физику мягкого вещества в двух измерениях. Благодарим вас за интерес к нашей работе и за просмотр.