Multi-электрод массив записей из нейронов Лавины в органотипической культур

Целью данного эксперимента является изучение самоорганизации нормальной активности мозга в нейронные лавины, которые являются признаком динамики критического состояния в коре. Это достигается путем совместного культивирования коронального среза слоистой коры и среза среднего мозга, который обеспечивает важные для развития дофаминергические входы в кору. На втором этапе ко-культура коры и среднего мозга выращивается на мультиэлектродной матрице, что позволяет осуществлять многоточечную стимуляцию и регистрацию нейронной активности в культуре.

Затем мы оставляем кокультуру для распластывания, расширения и прикрепления к поверхности MEA в течение первых одной-двух недель в специально сконструированном инкубаторе, который обеспечивает циклическое воздействие на культуру обычного воздуха и питательной среды. Полученные данные показывают спонтанную самоорганизацию пространственно-временных всплесков локального полевого потенциала в нейронные лавины. Это определено на основе записей MEA и офлайн-анализа лавин, выявляющего степенной закон в размерах лавин.

Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как диссоциированные культуры, заключается в его системном нейробиологическом аспекте. Мы можем совместно культивировать множество областей мозга, и такие многообластные культуры формируют организацию мозга, которая является корректной в крупных масштабах, например, на уровне кортикальных слоев и проекционных систем. Применение данной методики выходит за рамки одного лишь изучения нейронных лавин.

Например, мы можем изучить реакцию на стимул на уровне сети в точно контролируемых условиях in vitro. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как правильное нанесение смеси плазмы и тромбина, а также позиционирование ткани на MEA сложно освоить. Эти этапы требуют соблюдения временных интервалов, правильного температурного градиента и исключения прямого контакта с чувствительной поверхностью MEA.

Для подготовки стерильной герметичной стеклянной камеры для записей сначала отсеките резьбовые стеклянные цилиндры с тефлоновым пластиковым колпачком примерно в двух миллиметрах от основания резьбы. Это необходимо для надежного и плотного закрытия камеры для культивирования. Затем очистите стеклянные кольца, трижды промыв их водой, после чего прокипятите в течение пяти минут в 200-процентном этиловом спирте.

Отложите их для высыхания. Для прикрепления стеклянных колец к поверхности MEA потребуется силиконовый раствор. Используйте комплект силиконового эластомера Cell Guard 180 4 и тщательно смешайте по 15 миллилитров компонентов A и B. Затем оставьте смесь на 15 минут для удаления пузырьков воздуха.

Разделите раствор на аликвоты по 1 mL и храните при −20 °C для последующего использования. Теперь приклейте стеклянное кольцо к MEA: наберите 1 mL силикона при 23 °C в шприц с иглой малого диаметра и нанесите его на нешлифованную поверхность среза стеклянного кольца. Затем центрируйте стеклянное кольцо относительно MEA и нанесите дополнительный слой силикона по внешнему краю кольца для обеспечения более герметичного уплотнения.

Оставьте смесь для отверждения на один-два часа при температуре около 60 °C на нагревательной плитке. Затем простерилизуйте камеру MEA и крышки камеры в ламинарном шкафу, промыв их трижды деионизированной водой, а затем трижды 70% спиртом, используя его для последнего промывания. Оставьте камеру в спирте на 10 минут.

После этого подвергните внутренние поверхности камеры и крышки воздействию УФ-излучения в течение 10 минут. Стерилизуйте в автоклаве при 120 °C в течение 45 минут. После стерилизации дайте им высохнуть.

Теперь покройте поверхность MEA внутри культуральной камеры поли-D-лизином. Новые MEA, используемые в данном эксперименте, довольно липофильны, поэтому покрытие проводится путем многократного нанесения капель. После этого удалите раствор с электродной сетки с помощью аспиратора.

Закройте камеру MEA крышкой для хранения и последующего использования. Данная процедура позволяет получить срезы коры и VTA примерно для 12 кокультур; ее следует проводить в ламинарном шкафу в стерильных условиях, используя здоровых животных в возрасте одного-двух дней после рождения. Общее время сбора тканей не должно превышать одного часа. После декапитации приступайте к извлечению мозга, сначала сделав два латеральных разреза ножницами, чтобы удалить кожу с волосистой части головы.

Удалите мягкие ткани, затем вскройте череп с помощью тонких глазных ножниц, сделав один сагиттальный разрез по срединной линии и один коронарный разрез на границе коры и мозжечка. Откиньте все четыре лоскута черепа, чтобы обнажить мозг. Затем с помощью заточенного шпателя сделайте фронтальный разрез через обонятельную луковицу.

Затем продвигайте шпатель поочередно под разные части мозга. Осторожно поднимите мозг из черепа и переместите его в охлажденный раствор GaZe для быстрого охлаждения и временного хранения.

Повторите вышеописанную процедуру для еще двух образцов мозга. Чтобы получить ткань VTA, перенесите мозг в стерильную сухую чашку Петри. С помощью небольшого шпателя удалите излишки жидкости, осторожно сдвинув каждый образец мозга в сторону примерно на один сантиметр.

Затем с помощью лезвия бритвы удалите ствол мозга, сделав вертикальный корональный разрез на уровне мозжечка. Теперь приклейте блок агара к монтажному диску для механической стабилизации мозга во время процедуры нарезки. После этого с помощью маленького шпателя нанесите тонкую линию суперклея на диск в нескольких миллиметрах перед блоком агара, следя за тем, чтобы клей не касался агара.

Перенесите каждый мозг и закрепите его передним полюсом вниз. Убедитесь, что передние полюса приклеены к монтажному диску, а вентральные стороны касаются агара без остатков клея. Это обеспечит надлежащую механическую стабилизацию при резке и легкость извлечения срезов.

Затем осторожно погрузите и закрепите монтажный диск с закрепленными мозгом в вибростат с охлажденным раствором ГОС. После этого с помощью тщательно очищенного лезвия бритвы выполните корональные срезы среднего мозга толщиной 400 мкм при максимальной частоте вибрации и относительно низкой скорости подачи; используя инвертированную пастеровскую пипетку с резиновой грушей, соберите и перенесите срезы, содержащие VTA, в чашки Петри размером 35×10 мм, заполненные стерильным охлажденным раствором ГОС для корковых срезов. Повторите предыдущие этапы нарезки, но сделайте вертикальный разрез между корой и мозжечком и закрепите четыре мозга фронтальным полюсом вверх.

Соберите примерно три корональных среза толщиной 350 микрометров, начиная с уровня стриатума. Затем, используя микронож из обломков лезвий бритвы, под стереомикроскопом вырежьте корональные секции шириной около двух миллиметров из областей фронтальной коры и среднего мозга, содержащих VTA. Поместите каждый фрагмент ткани в отдельные небольшие чашки, наполненные охлажденным раствором Газе.

Для начала закрепления ткани в первой позиции камеры MEA расположите MEA при комнатной температуре под стереомикроскопом так, чтобы электродная матрица была в фокусе. Затем поместите каплю плазмы объемом 25 µL в центр чистой, беспыльной и стерильной матрицы электродов. С помощью маленького шпателя осторожно переместите срез коры и VTA в каплю плазмы.

Теперь поместите MEA на охлаждающую пластину и заново настройте фокус. Дайте образцу охладиться в течение примерно 15 секунд, после чего добавьте 25 µl тромбина в каплю плазмы. Затем, используя наконечник пипетки с тромбином, аккуратно распределите смесь плазмы и тромбина по поверхности MEA небольшими круговыми движениями.

Будьте осторожны, чтобы не касаться хрупкой матрицы электродов напрямую. Затем аккуратно поместите кору на матрицу так, чтобы дорсальный край располагался вдоль второго ряда электродов. Таким образом, развивающиеся поверхностные слои в конечном итоге покроют оставшуюся часть матрицы.

Затем поместите VTA рядом с вентральной границей среза коры. Теперь накройте и неплотно закройте камеру MEA для поддержания высокой влажности. Оставьте сборку культуры MEA примерно на шесть минут в вытяжном шкафу при комнатной температуре для коагуляции плазменного тромбина.

Тем временем повторите процедуру для приготовления еще трех культур. Затем с помощью шприца объемом 1 cc с иглой калибра 25 по 5/8 осторожно добавьте по 600 µL культуральной среды в камеры для культур небольшими каплями. После этого плотно закройте камеру MEA и поместите модуль MEA с культурой на качающийся лоток для хранения внутри инкубатора.

Через два дня культивирования in vitro добавьте 10 µL ингибитора митоза. Затем, на четвертые сутки in vitro и далее каждые четыре дня, обновите питательную среду на 60%. В процессе нормального роста культура будет значительно уплощаться и немного расширяться в дорсальном направлении.

Вследствие развития поверхностных корковых слоев здоровая культура в светлом поле характеризуется непрозрачной сероватой тканью. Напротив, появление ярких отражающих везикул, характерных для погибших дегенеративных клеток примерно через 10–12 дней после подготовки культур, свидетельствует о том, что они готовы к регистрации и стимуляции. Для начала сеанса регистрации MEA переносят из лотка для хранения на записывающую головку.

Для записи локального полевого потенциала (LFP) используйте полосовой фильтр с диапазоном от 1 до 200 hertz. Многонейронную активность также можно изучать с помощью полосового фильтра в диапазоне от 300 до 3000 hertz. Здоровая спонтанная активность, как правило, возникает в виде вспышек различного размера и продолжительности.

Для изучения взаимосвязи между LFP и активностью отдельного нейрона можно рассчитать усредненные значения LFP, вызванные спайками. Для данных культур коры отрицательные отклонения LFP коррелируют с нейрональными спайками при регистрации вызванной стимулом активности. Сначала с помощью программного обеспечения, управляющего генератором стимулов, задаются временная форма сигнала и амплитуда стимулов.

Полезным paradigm стимуляции является однократный шок с контролируемым зарядом и электронейтральностью с биполярной прямоугольной формой сигнала. Далее выбирается электрод, который будет использоваться для подачи стимулов. Типичные ответы LFP, вызванные стимулами, выглядят схожими с всплесками спонтанной активности.

Схемы блокировки отключают усилители во время стимуляции для уменьшения артефактов стимула и предотвращения насыщения усилителя. Стимулирующему электроду требуется несколько секунд для восстановления после стимуляции, поэтому он не может быть использован для регистрации ответной активности. На MEA активность имеет тенденцию возникать в виде пространственно-временных кластеров с активностью на одном электроде, которая часто сопровождается активностью на других участках.

Одновременно с этим здесь представлены типичные формы сигналов LFP в такие периоды активности путем наложения трех кластеров, возникающих с интервалом в несколько секунд для каждого кластера. Отрицательные отклонения LFP наблюдаются на нескольких электродах в окне длительностью одна секунда; при извлечении пиков NLFP, пересекающих порог, равный нескольким отрицательным sd, активность в виде времени появления пиков NLFP удобно визуализировать в виде растровой диаграммы (Rasta), в которой столбцы точек представляют почти совпадающие NPS на различных электродах. Пространственно-временная организация этой активности довольно сложна.

Столбцы, которые выглядят более или менее однородными при низком временном разрешении, состоят из отдельных кластеров при более высоком временном разрешении, и так далее. Возникновение пространственных, GEOTEMPORAL и LFP кластеров в кортикальных сетях носит высокоорганизованный характер. В частности, эта организация является scale-invariant (масштабно-инвариантной) для нейронных лавин.

Это демонстрируется путем расчета вероятности размеров кластеров при заданном временном разрешении Delta T. Здесь кластеры состоят из NL FPS, которые возникают в одних и тех же или последовательных временных интервалах; когда размер такого кластера выражается в общем количестве NFPS на кластер или интегрированных амплитудах NLFP на кластер, распределение размеров кластеров демонстрирует степенной закон с показателем, близким к -1,5. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как аккуратно препарировать ткани мозга и выращивать культуры на многоэлектродных матрицах для изучения самоорганизации нейронной активности.

Эти методы также использовались для изучения взаимосвязи между спонтанной активностью и активностью, вызванной стимулом, в кортикальных сетях.