Эффективное доставки генов в нескольких территориях ЦНС Использование In Utero Электропорация

Общая цель данной процедуры заключается в изменении экспрессии генов в нейронах эмбриональной центральной нервной системы. Для этого сначала подбирают беременных самок с известным сроком беременности и подготавливают их к операции. Затем путем выполнения абдоминального разреза обеспечивают доступ к рогам матки.

После обнажения эмбрионов ДНК вводят в боковой желудочек, третий желудочек или субретинальное пространство. Заключительным этапом процедуры является подача электрического тока на эмбрион через стенку матки, при этом лопастные электроды ориентируют так, чтобы положительный полюс находился над предпочтительным участком трансфекции. В конечном итоге с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие пролиферацию, миграцию и дифференцировку нейропрогениторов в tline kelon dying kelon и сетчатке.

Основное преимущество данной методики по сравнению с существующими методами, такими как создание трансгенных мышей, заключается в ее быстроте, возможности проведения высокопроизводительных исследований и более низкой стоимости. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроразвития, например, о том, какие гены регулируют поведение нейральных предшественников, пролиферацию клеток, спецификацию клеточного fates, нейрональную дифференцировку и миграцию клеток. Значимость данной техники может привести к более глубокому пониманию генетических путей, лежащих в основе дефектов развития ЦНС, многие из которых приводят к когнитивным нарушениям и поведенческим расстройствам у людей, что выходит за рамки ее полезности в понимании развития центральной нервной системы.

Данный метод также может быть применен к другим системам органов, таким как развивающаяся периферическая нервная система, сердце и плацента. Его также можно использовать для изучения моделей заболеваний у мышей, а также других модельных организмов, таких как цыпленок и xip. Как правило, основным препятствием для тех, кто только осваивает эту технику, является выживаемость эмбрионов; при манипуляциях, инъекциях и переносе эмбрионов следует соблюдать осторожность.

Идея этого метода возникла у нас, когда потребовался быстрый способ манипулирования экспрессией генов в эмбриональном телэнцефалоне и сетчатке. Мы разработали этот метод в нашей лаборатории, модифицировав технику, первоначально описанную Sal и опубликованную в журнале Developmental Biology в 2001 году. Мы также сотрудничали с партнерской лабораторией для внедрения данного протокола в развивающемся дилоне.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы инъекции и электропорации трудно освоить, поскольку они требуют очень осторожного обращения с эмбрионами, а места инъекций иногда могут быть очень маленькими. Например, субретинальное пространство. Демонстрировать процедуру сегодня будет Раджив, постдок из лаборатории Шермана. Для начала очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты. Затем наполните шприцы физиологическим раствором и раствором Рингера с лактатом и поместите их на нагревательную подушку для подогрева в зоне проведения операции.

Стерилизуйте грелку 70% ethanol, затем накройте ее стерильной безворсовой марлевой салфеткой. Установите температуру грелки на 37 °C. Поместите животное в небольшую анестезиологическую камеру и проведите анестезию, подавая 5% isof fluorine с кислородом со скоростью одного литра в минуту через испаритель.

Обязательно обеспечьте сбор выхлопа изофлурана с помощью системы очистки. Когда дыхание животного станет глубоким и регулярным, извлеките его из камеры. Для проверки используйте рефлекс щипка за палец и мигательный рефлекс.

Для обеспечения полной анестезии поместите обезболенного животного на живот и используйте респираторную трубку для подачи 2,25% изофлурана во время операции. Подкожно в области затылка введите бупренорфин в концентрации 0,1 мг/кг массы тела.

Продолжайте контролировать дыхание животного и при необходимости отрегулируйте поток изофлурана. Затем наложите пластырь на грудную клетку анестезированного животного и повторно проверьте наличие ретракционного рефлекса, зажав заднюю стопу тупым пинцетом. С помощью стерильного ватного тампона нанесите толстый слой крема на живот, убедившись, что подшерсток полностью покрыт средством.

Оставьте крем примерно на три минуты, периодически проверяя степень удаления волос. С помощью стерильного тампона смочите стерильную марлевую салфетку стерильной водой и удалите волосы с живота. Затем стерилизуйте место разреза хлоргексидином и дополнительным количеством воды.

Промокните живот чистой стерильной марлей. Повторите этот шаг, используя 70% ethanol и свежую стерилизованную хлопковую марлю. Подготовьтесь к операции, надев хирургическую одежду, чтобы обеспечить доступ к рогам матки.

Сначала найдите белую линию (linea alba), которая выглядит как слабая полоса под кожей по срединной линии. С помощью пинцета оттяните кожу от брюшной стенки и выполните небольшой прямой разрез от середины живота вниз, используя изогнутый пинцет и ножницы для кожи. Повторите эту процедуру с брюшиной. Захватите брюшину пинцетом.

Отодвиньте ткани, затем сделайте разрез, достаточный для извлечения матки. Поместите над разрезом стерильную марлю с небольшим вертикальным прорезом и увлажните ее теплым стерильным физиологическим раствором. Затем введите пинцет в разрез, найдите матку, удерживая разрез открытым с помощью пинцета.

Захватите матку между первым и вторым видимыми эмбрионами и вытяните обе стороны рогов матки на марлю. Подсчитайте количество эмбрионов, отметив любые случаи резорбции или эмбрионы с малым размером тела. Чтобы подготовить нужное количество инъекций ДНК, смочите рога матки физиологическим раствором и осторожно верните один рог матки в брюшную полость.

Для заполнения хирургических игл используйте стеклянную дозационную пипетку с насадкой-мундштуком, чтобы набрать 10 µL раствора ДНК концентрацией 3 mg/mL, очищенного от эндотоксинов и содержащего краситель метиловый зеленый, после чего введите ДНК в хирургическую иглу. Установите первую заполненную иглу в микроманипулятор.

Установите инъектор, начиная с эмбриона, расположенного ближе всего к яичнику. С помощью кольцевых пинцетов осторожно поверните эмбрион внутри децидуальной оболочки так, чтобы он был обращен лицом вперед, обеспечивая возможность проведения инъекций в направлении от ROS-ролика к пуповине. Используйте волоконно-оптический источник света для определения срединной линии головного мозга эмбриона.

Обратите внимание на расширенные боковые желудочки в ростральных отделах. Удерживайте эмбрион с помощью изогнутого пинцета и расположите заполненную хирургическую иглу над маткой таким образом, чтобы угол введения в мозг составлял примерно 45 градусов. Быстрым и уверенным движением поверните ручку микроманипулятора, чтобы ввести кончик иглы через стенку матки в боковой желудочек головного мозга эмбриона.

Затем нажмите на педаль микроинжектора. При введении раствора ДНК успешность инъекции легко определить по распространению красителя метилового зеленого по желудочкам головного мозга эмбриона. После того как ДНК была введена, медленно вытяните иглу вверх, чтобы извлечь ее, не вызвав повреждений.

Поместите инъецированный эмбрион на стерильную марлю и тщательно смочите теплым физиологическим раствором. Зажмите матку положительным полюсом пластинкового электрода, расположенным над выбранным участком трансфекции. Затем подайте пять прямоугольных электрических импульсов напряжением 40–50 вольт и длительностью 50 миллисекунд с частотой один импульс в секунду.

Накройте инъецированный и подвергнутый электропорации эмбрион защитной влажной марлей, затем переходите к инъекции следующего эмбриона. После завершения инъекций и электропорации всех необходимых эмбрионов в роге матки осторожно верните его в брюшную полость. Извлеките второй рог матки, чтобы начать инъекцию и электропорацию оставшихся эмбрионов.

После того как все эмбрионы будут возвращены в матку, введите в брюшную полость два-три миллилитра теплого физиологического раствора, а затем удалите марлю с живота, чтобы обнажить края брюшины. Используя черную плетеную шелковую нить, наложите швы на брюшину, закрепив нить на участке брюшины, ближайшем к грудине, и прошивая ткани в направлении от места закрепления. Убедитесь, что все швы затянуты плотно и что в шов не захвачены подлежащие органы или кожа.

Обрежьте оставшуюся линию шва и удалите ее. С помощью пинцета стяните кожу над линией шва, используя скобы для закрытия кожи. Зафиксируйте кожу скобами, стараясь не задевать внутреннюю линию шва и не натягивать кожу слишком сильно.

По завершении убедитесь, что скобы плотно зафиксированы, осторожно прижав их друг к другу с помощью инструмента для наложения швов здесь. В развивающийся неокортекс на стадии E 12 был электропорирован экспрессионный вектор A-P-C-I-G, обеспечивающий экспрессию GFP. По мере развития неокортекса апикальные предшественники дифференцируются либо во вторичные базальные предшественники, либо в постмитотические нейроны, продолжая экспрессировать GFP. Затем в этих нервных клетках можно проанализировать экспрессию типичных маркеров нейронального подтипа, отмеченных красным цветом.

На данном вентральном виде переднего мозга эмбриона, подвергнутого электропорации на стадии E 12 и препарированного на стадии E 14, место электропорации отмечено зеленой эпифлуоресценцией к стадии E 14. Экспрессия GFP наблюдается в таламусе, преталамусе и гипоталамусе, что свидетельствует об успешной трансфекции соответствующих областей. Пунктирная рамка обозначает место проведения среза через одну из вентрикулярных зон.

При более детальном рассмотрении вентрикулярной зоны видна миграция GFP-клеток из вентрикулярной зоны в мантийную зону. Эмбриональная сетчатка, где будут формироваться гипоталамические ядра, также легко подвергается электропорации, что показано на данном корональном срезе через эмбрион E 16.5, электропорированный PCIC на стадии E 15.5. Здесь накопление m cherry-положительных клеток специфично для внешнего нейробластного слоя и не наблюдается в Brn3b-положительных ганглиозных клетках сетчатки в слое ганглиозных клеток. После освоения эта методика может быть выполнена за 30 минут при отсутствии непредвиденных осложнений.

При выполнении данной процедуры важно соблюдать надлежащие правила стерильности, проявлять осторожность и точность при манипуляциях с эмбрионами, а также подготовить все необходимые материалы до введения беременной самки под наркоз. После проведения данной процедуры электробрайдированные эмбрионы могут развиваться до взрослого состояния, после чего можно применять другие методы, такие как поведенческий и функциональный анализы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как манипуляции с определенными генами в эмбрионе влияют на функцию нейронов у взрослых особей. С момента своего появления этот метод открыл исследователям в области развития ЦНС возможность изучать функцию генов in vivo у мышей.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как вводить чужеродную ДНК в эмбриональную нейральную трубку. В частности, мы продемонстрируем, как подготовить беременную самку к операции, обнажить матку, ввести ДНК и провести электропорацию эмбриона.

Не забывайте, что работа с изофторфланом может быть опасной, и при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование системы очистки воздуха (скраббера).