Применение постоянных средней мозговой артерии Лигирование в мышь
25 июля 2011 г.
Средней мозговой артерии (СМА) лигирование является методика исследования координационного ишемии мозга на животных моделях. В этом методе, средней мозговой артерии, предоставляемые трепанации черепа и лигируют путем прижигания. Этот метод дает очень воспроизводимые инфаркта объемов и увеличение послеоперационной выживаемости по сравнению с другими методами.
Общая цель данной процедуры заключается в изучении фокальной ишемии головного мозга на моделях животных. Сначала делают небольшой разрез кожи между левым глазом и основанием уха. Затем в месте соединения скуловой дуги и чешуйчатой части височной кости проводят краниотомию для обнажения средней мозговой артерии, после чего среднюю мозговую артерию лигируют с помощью коагулятора для мелких сосудов.
В завершение кожу зашивают для закрытия раны. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие инфаркт, локализованный в левом полушарии мозга мыши. Для визуализации инсульта мозг можно окрасить TTC или просканировать с помощью МРТ.
Мозг после инсульта также может быть использован для определения экспрессии белков или мРНК. Здравствуйте, я Гарса Чола, аспирант в лаборатории Гейл Джонсон в Рочестерском университете.
Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения инсульта, например, проиллюстрировать механизмы, приводящие к гибели клеток в ишемизированном мозге. Для подготовки к операции простерилизуйте все хирургические инструменты, марлевые салфетки и когнитивные аппликаторы в автоклаве. В ходе операции держите хирургические инструменты в 70% ethanol и высушивайте их на стерильной марле непосредственно перед использованием.
За два часа до операции обработайте рабочую зону распылением 70% ethanol. Введите мыши бупренорфин в дозе 0.05 milligrams per kilogram. Препарат следует ввести повторно сразу после операции, а затем каждые три–пять часов в течение первых 24 hour послеоперационного периода.
Используйте испаритель анестетика для наркотизации мыши смесью газов, состоящей из 3% ISO fluorine и 20% oxygen. Регулируйте подачу кислорода с помощью расходомера. Проверяйте глубину анестезии путем сжатия пальца или хвоста.
Поддерживайте уровень анестезии с помощью 2% изофлурана. Закапайте в глаза мыши искусственные слезы, соблюдая осторожность, чтобы не повредить глаз во время хирургической процедуры.
Поместите мышь на правый бок в латеральное положение, используя фиксатор для животных. Выбрейте шерсть на левой стороне между левым глазом и основанием левого уха. Очистите эту область, поочередно используя раствор Бетадина и 70%eth этанол, аккуратно протирая кожу ватными тампонами.
Необходимо повторить процедуру. Поместите мышь на нагревательную подушку, подключенную к ректальному датчику. Чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C, введите ректальный датчик, используя минеральное масло. Положите мышь на правый бок под микроскопом и зафиксируйте ее лентой.
Вырежьте отверстие в марлевой салфетке и прикройте операционное поле, используя тонкие прямые ножницы. Сделайте вертикальный разрез между левым глазом и основанием левого уха. Если в ходе операции происходит чрезмерное высыхание тканей, используйте изогнутые гемостаты, чтобы держать операционную область открытой.
С помощью ватных тампонов нанесите стерильный PBS. Используя пружинные ножницы, сделайте горизонтальный разрез височной мышцы и осторожно раздвиньте ткани пинцетом, чтобы слегка отделить височную мышцу от черепа. Зафиксируйте челюстную кость изогнутым пинцетом и с помощью иглы 18 gauge выполните небольшую субтемпоральную краниотомию в месте соединения скуловой дуги и чешуи височной кости.
С помощью костных кусачек удаляют небольшие фрагменты черепа, чтобы обнажить MCA. В ходе этого процесса следует избегать повреждения скуловой дуги и содержимого орбиты. С помощью коагулятора для мелких сосудов лигируют дистальный отдел MCA, возвращают височную мышцу в исходное положение и накладывают швы нейлоном 5-0.
Для закрытия места разреза прекратите подачу анестезии и извлеките ректальный зонд. Введите мыши вторую дозу бупренорфина подкожно. Поместите мышь обратно в клетку, которая поддерживалась при температуре 37 °C.
С использованием нагревательной панели. В течение следующих 24 часов внимательно наблюдайте за мышью на предмет любого дискомфорта, включая снижение аппетита или потребления воды, сгорбленную позу, учащенное дыхание или пилоэрекцию шерсти. Сразу после операции обеспечьте мышь восстанавливающим гелем.
Подождите от двух до трех часов после операции. Затем вводите мыши бупренорфин подкожно каждые три-пять часов в течение 24 часов. Через 24 часа после операции глубоко анестезируйте мышь и проведите перфузию 4% TTC.
Извлеките головной мозг и поместите его в 4% раствор параформальдегида на ночь. На следующий день зафиксируйте мозг в блоке для секционирования. С помощью лезвий бритвы нарежьте мозг на срезы толщиной 1 мм.
Поместите срезы рядом с миллиметровой шкалой. Используя цифровую камеру, подключенную к диссекционному микроскопу, сфотографируйте срезы с помощью программного обеспечения ImageJ.
Нажмите на меню «Файл» и откройте нужное изображение. В программе выберите вкладку «Прямая линия». Проведите прямую линию между двумя отметками на линейке.
Нажмите на меню «Analyze» и выберите «Set Scale». Установите известное расстояние равным one, а единицу длины — millimeter. Перейдите на вкладку «Freehand circle».
Обведите контур контрлатерального полушария, начертив круг. Откройте меню «analyze» и выберите «measure». Появится окно с результатами вычислений, в котором будет указана площадь начерченного круга.
Обведите еще одним кругом ипсилатеральное полушарие, исключая область белой обводки. Измерьте площадь, как показано ранее. Новое значение будет добавлено в окно расчетов.
Разница между первым и вторым значениями представляет собой площадь инфаркта. Рассчитайте площадь инсульта в каждом срезе, повторив вышеописанные действия для толщины среза 1 мм. Рассчитайте объем инсульта путем суммирования площади инсульта, вычисленной для каждого среза.
На этом рисунке показано окрашивание мозга TTC через 24 часа после постоянного перевязывания средней мозговой артерии (MCA) у мыши линии C 57 BL six дикого типа. Очаг инсульта выглядит белым и может быть виден при разном увеличении и под разными углами. Здесь представлены срезы окрашенного TTC мозга с инсультом толщиной 1 мм, от переднего до заднего отдела инфаркта.
Объем был рассчитан через 24 часа после операции. Объем инфаркта составляет приблизительно 23 cubic millimeters. При правильном выполнении данная методика занимает 30 минут.
Спасибо за просмотр.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Метод лигирования средней мозговой артерии (СМА) используется для изучения очаговой ишемии головного мозга на моделях животных. Данный метод предполагает обнажение и перевязку средней мозговой артерии, что позволяет добиться воспроизводимого объема инфаркта и повысить показатели послеоперационной выживаемости.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования инсульта
- Модели на животных
Теоретическая часть
- Очаговая ишемия головного мозга является критически важной областью исследований для понимания механизмов инсульта.
- Метод перевязки средней мозговой артерии (СМА) позволяет проводить контролируемые эксперименты.
- Модели на животных дают представление о механизмах инсульта у людей.
- Повышение показателей выживаемости увеличивает достоверность результатов.
Цель исследования
- Исследование эффектов фокальной ишемии головного мозга.
- Оценка объемов инфаркта в контролируемых условиях.
- Углубление понимания патологии инсульта.
Используемые методы
- Разрез выполняется между левым глазом и основанием ушной раковины.
- Трепанация черепа проводится на уровне скуловой дуги и чешуйчатой части височной кости.
- Средняя мозговая артерия перевязывается с помощью коагулятора для малых сосудов.
- После завершения процедуры кожа зашивается для закрытия раны.
Основные результаты
- Инфаркт расположен в левом полушарии мозга мыши.
- Визуализация инсульта была осуществлена с помощью окрашивания TTC или МРТ.
- Результаты демонстрируют эффективность метода лигирования СМА.
- Отмечена высокая воспроизводимость объемов инфаркта.
Выводы
- Лигирование средней мозговой артерии (СМА) является надежным методом изучения очаговой ишемии головного мозга.
- Повышение показателей выживаемости способствует достоверности полученных результатов.
- Данный метод может быть использован для дальнейшего исследования способов терапии инсульта.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной индустрии
Модель перманентного лигирования средней мозговой артерии представляет собой воспроизводимую систему для изучения фокальной ишемии головного мозга, позволяющую проводить механистическую проверку безопасности нейропротекторных соединений в доклинических исследованиях инсульта. Создавая стабильные объемы инфаркта у мышей, данный метод способствует валидации мишеней и разработке анализов для терапевтических кандидатов, направленных на решение неудовлетворенных медицинских потребностей при ишемическом инсульте. Ее релевантность патологии человека, при которой ~80% инсультов происходят в бассейне СМА, повышает трансляционную достоверность и эффективность сортировки портфеля препаратов на ранних этапах разработки.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы о путях развития ишемии посредством контролируемого индуцирования фокальной ишемии.
- Научная ценность: способствует биологическому снижению рисков путем уточнения роли мишени в формировании ядра инфаркта и пенумбры.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимую количественную оценку инфаркта с помощью окрашивания ТТХ, что облегчает последовательную оценку взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для скрининга соединений путем создания релевантной модели ишемии при данной патологии.
- Практическая ценность: Стандартизация измерения инфаркта с помощью волюметрии на основе TTC, что позволяет проводить количественный анализ зависимости «доза-эффект».
- Практическая ценность: Повышение воспроизводимости анализа при уровне выживаемости ~80%, что снижает вариативность фармакологических показателей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует патологию инсульта у человека с высокой анатомической и патофизиологической релевантностью по отношению к инфарктам в бассейне средней мозговой артерии (СМА).
- Научная ценность: Позволяет оценивать механизмы внутриклеточного ответа на гипоксию in vivo, что способствует поиску новых биомаркеров.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации благодаря стандартизированным протоколам хирургического вмешательства и окрашивания.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки — от валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, предоставляя платформу для снижения рисков за счет изучения механизмов действия терапевтических средств при инсульте.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез относительно нейропротекторных мишеней, обеспечивая контролируемое нанесение ишемического повреждения и количественную оценку инфаркта.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного окрашивания TTC, позволяя получать количественные данные об объеме инфаркта для оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет получать волюметрические измерения (например, инфаркт ~23 mm³ через 24h), что дает возможность сравнивать различные условия и определять величину эффекта.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническим этапом за счет локализации инфаркта, имитирующей паттерны инсульта у человека, что способствует продвижению исследований с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: Служит в качестве воспроизводимой платформы для оценки множества соединений в рамках различных проектов благодаря высокой повторяемости и стандартизированным конечным точкам.
Операционное и организационное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в ишемических путях.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным процедурам краниотомии, лигирования и окрашивания ТТЦ.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет предоставления надежных данных об инфаркте, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ по лечению инсульта.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов в нейропротекторы с учетом рисков на основе согласованных сигналов доклинической эффективности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии грызунов и нейроанатомической идентификации MCA.
- Зависит от наличия микрохирургического инструментария, включая коагуляторы сосудов, нагревательные маты и инструменты для прецизионного наложения швов.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов анестезии, анальгезии и послеоперационного мониторинга.
- Требуется адаптация методов при переходе от моделей крыс к моделям мышей, включая подбор размера шовного материала и точность окклюзии.
- Ограничено необходимостью терминальных точек для количественной оценки инфаркта с помощью окрашивания TTC или МРТ.
