Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации биомолекул, таких как ДНК и белки, в водных буферах в режиме реального времени с помощью атомно-силовой микроскопии. Для этого сначала подготавливаются биомолекулы для визуализации. Затем настраивается атомно-силовой микроскоп и позиционируется кантилеверный зонд для работы в режиме частотной модуляции (FM).

Затем проводят визуализацию и анализ поверхности образца и интересующих биомолекул. В конечном итоге с помощью атомно-силовой микроскопии в буферных условиях можно получить результаты, демонстрирующие общий размер, количество и организацию ДНК и белков, а также гетерогенных биомолекулярных комплексов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярных шаперонов, например, какова геометрия STO комплекса шаперонов и кошаперонов с клиентом.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, поскольку этапы подготовки AFM и зонда Kent lever может быть трудно освоить по печатным инструкциям, главным образом из-за сложности физических манипуляций с ними. Процедуру продемонстрируют Морган Шэннон и Джон Герц, два студента из моей лаборатории. Для начала изолируйте молекулы белка или ДНК, которые необходимо визуализировать, и суспендируйте их в водном буфере. После подтверждения чистоты образца инкубируйте его в адсорбционном буфере для AFM на льду, чтобы способствовать адгезии образца к слюде.

Для белковых образцов используйте 10 мМ HEPES-буфер. Для ДНК подходящим для установки АСМ-зонда будет буфер, содержащий магний и состоящий из 10 мМ Трис (pH 7,5), 10 мМ хлорида натрия и 2 мМ хлорида магния. Поместите держатель зонда жидкостной ячейки на соответствующую док-станцию для установки кантилеверов.

Найдите длинный толстый консольный рычаг острого нитридного зонда, который будет использоваться для получения изображений. Осторожно перенесите его в держатель зонда жидкостной ячейки, следя за тем, чтобы кончик оставался в вертикальном положении. Затем осмотрите консольный рычаг под световым микроскопом, чтобы убедиться в его целостности и правильной установке в держателе зонда жидкостной ячейки.

Затем осторожно снимите головку a FM с направляющего крепления прибора, затянув винт зажима нейронной головки. Переверните головку a FM и плотно прижмите держатель зонда жидкостной кюветы к четырем штифтам в основании головки a FM. В завершение осторожно установите головку a FM обратно в направляющее крепление прибора.

Для дальнейшей подготовки FM перед визуализацией образцов переместите ручки встроенного светового микроскопа, чтобы найти кончик кантилевера, и с помощью стрелок «вверх» и «вниз» контроллера оптики в программном обеспечении настройте фокус на кончике кантилевера. Используйте ручки регулировки лазера, чтобы направить лазер на кончик кантилевера. Это один из самых сложных технических этапов протокола; позиционирование выполняется вручную и требует точной настройки ручек регулировки.

Тщательный мониторинг лазера в пятне отражения и пятне освещения повышает вероятность успешной юстировки. Затем с помощью регуляторов фотодетектора на головке АСМ отцентрируйте фотодетектор. Поместите свежесколотый лист слюды, закрепленный на металлическом диске для образцов АСМ, на намагниченный держатель образца, расположенный на пластине держателя АСМ.

Поверните пластину держателя AFM так, чтобы диск с образцом был расположен для начальной визуализации. Используйте функцию управления поверхностью фокусировки в программном обеспечении прибора, чтобы переместить головку AFM вниз к поверхности диска с образцом MICA. Выберите значок настройки в программном обеспечении прибора и настройте кантилевер до тех пор, пока отчетливые особенности поверхности MICA или отражение от зонда не окажутся в фокусе.

Резонансная частота рекомендуемых зондов MSNL или SNL составляет от 20 до 60 килогерц. Для получения изображения образца MICA выберите смещение пика 5%. Сначала приведите зонд в контакт с поверхностью MICA, установив начальный размер сканирования 10 микрометров, а скорость сканирования — один герц.

Получите полные сканированные изображения области размером 10 микрометров. Затем уменьшите область сканирования до 5 и 0,5 микрометров и получите полные изображения каждой области. Отсоедините зонд, один раз нажав на значок отсоединения в программном обеспечении прибора.

Для визуализации интересующих биомолекул смешайте 5 µL подготовленного образца с 45 µL свежего абсорбционного буфера. Осторожно нанесите 50 µL раствора, содержащего биомолекулы в концентрации 0,5 µg/mL, непосредственно на поверхность MICU. Подождите пять минут, чтобы биомолекулы из образца адсорбировались на поверхности слюды.

Затем с помощью пипетки добавьте еще 50–100 µL абсорбционного буфера в держатель зонда жидкостной ячейки. Осторожно, не касаясь зонда, головки FM или MICA наконечником пипетки, при необходимости заново настройте фотодетектор и юстируйте лазер относительно кантилевера. После этого используйте программное обеспечение прибора, чтобы повторно активировать зонд.

Увеличьте область сканирования, чтобы определить интересующие области. После завершения визуализации несколько раз нажмите значок отвода в программном обеспечении прибора, чтобы вывести зонд. В завершение тщательно промойте держатель зонда жидкостной ячейки и диск с образцом дистиллированной водой.

Затем попробуйте использовать сжатый воздух. Здесь приведен пример изображения, полученного методом АСМ. Слюдящая подложка обеспечивает молекулярно-гладкую поверхность, на которой могут адсорбироваться ДНК и белки.

Визуализация MICA перед анализом биомолекулярных образцов служит отрицательным контролем и позволяет оценить уровень шума при получении изображений. Это также дает определенную уверенность в том, что кантилевер правильно настроен и последующая визуализация образцов пройдет успешно. Двуцепочечная плазменная ДНК, предположительно суперскрученная, легко идентифицируется по ее асимметричному виду и равномерному осаждению на ранее однородную подложку Micah.

Белковые комплексы с различными размерами частиц также однозначно отличимы от подложки Micah. Различия в размере частиц указывают на гетерогенность образца и могут быть полезны для аппроксимации стехиометрической геометрии белка или комплекса, а также их биохимической активности. Наблюдаются общая диагональная форма и единообразная ориентация белковых частиц.

Здесь представлен артефакт визуализации, поскольку белки, как и ожидалось, ориентированы на подложке из слюды случайным образом. Возможными причинами наблюдаемого артефакта могут быть либо физическая аномалия зонда, либо проведение АСМ-визуализации при слишком высокой скорости сканирования, при которой свертка зонда препятствует расчету абсолютных значений длины по осям X и Y; тем не менее, измерения высоты по оси Z и относительные измерения по осям X и Y могут быть полезны для оценки биофизических свойств визуализируемых биомолекул. При выполнении данной процедуры важно не забывать точно настраивать кантилевер и юстировать фотодетектор в соответствии с данной базовой процедурой АСМ.

Для ответа на дополнительные вопросы, например, о способности молекулярных шаперонов влиять на высвобождение стероидных рецепторов из их элементов ответа ДНК, могут быть добавлены другие этапы, включая использование ячейки для обмена буфера. После просмотра этого видео вы должны лучше понять, как выполнять визуализацию белков ДНК и биомолекулярных комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии в буферных условиях.