Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Общая цель данной процедуры заключается в использовании анализа супрессии клеток человека in vitro для измерения функции treg и возможного прогнозирования будущей потери их функциональности. Это достигается путем предварительного приготовления и тестирования кодированных микросфер, которые будут использоваться в качестве стимуляторов клеток. Следующим шагом является изоляция чистых наивных CD4-положительных CD25-отрицательных T-клеток, активированных in vivo CD4-положительных CD25-low T-клеток и регуляторных CD4-положительных CD25-high T-клеток, а также облученных PP BMCs для использования в качестве антигенпрезентирующих клеток или APCs.

Затем подготавливают монокультуры наивных или активированных T-клеток в качестве респондеров с П БМК в качестве АПК, либо кокультуры при тех же условиях, но с добавлением tregs в соотношении 1:10. Заключительным этапом является сбор клеток и измерение их пролиферации по включению тритиевого тимидина. Полученные в итоге результаты могут продемонстрировать различия в подавлении ответов наивных T-клеток по сравнению с T-клетками, активированными in vivo.

Меня зовут Джефф Вудклифф. Регуляторные Т-клетки не экспрессируют уникальных маркеров клеточной поверхности. Следовательно, для достоверного измерения их функции их необходимо изолировать с помощью методов, обеспечивающих наилучшее разделение.

Основным преимуществом использования флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) по сравнению с другими методами, такими как максимальная изоляция, является возможность получения высокочистых популяций клеток. Затем можно надежно проверить функцию клеток в тестах на супрессию in vitro, как показано здесь. Этот метод позволяет изучить функцию treg у здоровых людей и субъектов с сахарным диабетом 1 типа. Он также может быть применен к другим аутоиммунным заболеваниям, таким как ревматоидный артрит человека, системная красная волчанка, рассеянный склероз и другие. Для покрытия активированных бусин anti-human CD3.

Добавьте 1 мл активированных магнитных частиц M4 50 из исходного флакона в пробирку объемом 1,5 мл и поместите пробирку в магнитный штатив до тех пор, пока все частицы не притянутся к стенке пробирки. Затем удалите буфер для частиц, отсосав его пипеткой, пока пробирка все еще находится в магнитном штативе. После этого извлеките пробирку из магнитного штатива и добавьте 1 мл буфера 1.

Снова поместите пробирку в магнитный штатив. Удалите буфер, пока пробирка находится в магнитном штативе. Снова ресуспендируйте гранулы в 1 мл буфера 1.

На этот раз также добавьте 40 µL антител к человеческому CD3. Перемешивайте гранулы с антителами при 37 °C в течение 15 минут. Затем добавьте 0,1% (w/v) BSA и продолжайте перемешивание в течение следующих 16 часов.

Затем дважды промойте гранулы буфером 2, инкубируя их в одном миллилитре буфера 2 в течение пяти минут при температуре от 2 до 8 °C, после чего удалите буфер, удерживая пробирку в магнитном штативе. Затем промойте гранулы еще один раз в тех же стерильных условиях.

Используя один миллилитр буфера три, протестируйте эффективность покрытия антителами, добавляя различное количество покрытых CD3 бусин на одну клетку, чтобы определить оптимальное соотношение и ALI, используя по 50 000 PBMC в трех повторностях в каждой лунке 96-луночного планшета. После 72 часов культивирования при 37 °C добавьте один микрокюри тритированного тимидина и продолжайте инкубацию в течение следующих 16 часов. Соберите клетки в многоканальный планшет для сбора или аналогичный.

Добавьте сцинтилляционную жидкость и определите количество импульсов в минуту или CPM для каждой лунки. С помощью сцинтилляционного счетчика TopCount NXT или аналогичного прибора определите соотношение микросфер и клеток; по нашему опыту следует использовать соотношение, при котором CPM стабильно превышает 5 000, но не превышает 15 000. Соотношение три микросферы на одну клетку обычно обеспечивает оптимальную стимуляцию как эффекторных клеток, так и treg-клеток у всех протестированных субъектов-людей.

Налейте 15 мл фалькона с плотностью (Ficoll-Paque) в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем проведите разведение баффи-кот (лейкоцитарного слоя) в пропорции 1:6, добавив 250 мл PBS к 50 мл крови. Медленно и осторожно, не нарушая целостности слоев, нанесите 25 мл разведенного баффи-кота поверх слоя Ficoll-Paque.

Центрифугируйте при 800 ×g в течение 30 минут при температуре 4 °C. При выключенном торможении осторожно соберите слой PBMC, который представляет собой белую промежуточную фазу между фиколом и буфером. При необходимости соберите клетки со стенок пробирки.

Подождите несколько минут и снова соберите их из промежуточной фазы. Перенесите клетки в новые пробирки объемом 50 мл и промойте их, наполнив пробирки PBS, затем центрифугируйте для получения осадка. ПБМк.

Повторите этап промывки дважды в каждом случае. Объединяйте по два осадка клеток в одной пробирке, пока все осадки клеток не будут собраны в одной пробирке объемом 50 миллилитров. Затем используйте 20 µL суспензии клеток для определения жизнеспособности клеток методом исключения трипанового синего.

Подготовьте тестовые АПК, перенеся 1 mL жизнеспособных PBMC в новую пробирку. Затем добавьте 4 mL среды и облучите клетки дозой 5,000 rad; пробирку с остатком PBMC долейте буфером PBS. После центрифугирования клеток при 250 ×g в течение 10 минут при 4 °C слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в 4 mL той же смеси.

Затем добавьте 200 µL магнитных микросфер anti-CD4 к PBMC и инкубируйте смесь клеток и микросфер при температуре 4 °C в течение 20 минут. После инкубации промойте клетки 40 мл буфера PBS, затем центрифугируйте их для осаждения. Слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в 8 мл дегазированного буфера PBS при комнатной температуре.

Затем используйте фильтры для предварительного разделения, чтобы отфильтровать клеточную суспензию. После этого разделите суспензию ПБМ на две пробирки по 15 мл, добавив в каждую пробирку по четыре миллилитра ПБМ.

Закрепите две колонки на сепараторе minimax и поместите пробирки для сбора под каждую колонку. Затем добавьте по 3 mL буфера PBS DGAs в каждую колонку. Когда буфер закончится, нанесите весь объем клеточного раствора (4 mL) из каждой пробирки на колонки до того, как клеточная суспензия полностью стечет. Добавьте по 3 mL буфера PBS DGAs комнатной температуры в каждую колонку и дайте буферу пройти в пробирки для сбора.

Добавляйте буфер до тех пор, пока он не станет прозрачным. Пипетируйте еще 5 мл буфера DGAs на колонки LS, после чего извлеките колонки LS из сепаратора minimax. Поместите колонки в новые стерильные пробирки для сбора объемом 50 мл.

Дайте вытечь 0,5 мл, а затем медленно вытолкните оставшийся объем, который составляет примерно 4 мл. Теперь объедините две фракции, положительные по CD4. Затем добавьте в пробирку до 50 мл PBS и подсчитайте количество клеток после центрифугирования при 400 ×g в течение 10 минут при 4 °C.

Ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах буфера PBS. Объедините антитела, которые будут использоваться для окрашивания фактов, в одной пробирке: анти-CD 14, CD 32, CD 16 и, по желанию, анти-CD 4. Возьмите аликвоту смеси для окрашивания пробирки «минус один флуорохром».

Подготовьте пробирку FMO, перенеся 5 µL клеточной суспензии из основной пробирки в пробирку для проточной цитометрии, и окрасьте клетки 2 µL предварительно подготовленного коктейля антител. Затем добавьте неокрашенные клетки и гранулы, покрытые мышиным IgG, в новые отдельные пробирки для проточной цитометрии для окрашивания одним флуорохромом с целью использования в качестве контролей компенсации при сортинге клеток. После этого добавьте к коктейлю 50 µL антител anti-human CD 25 PE и добавьте полученный коктейль к остальной части клеточной суспензии.

Инкубируйте пробирки при температуре 4 °C в течение 30 минут. После инкубации клеток с коктейлем антител добавьте к клеткам буфер PBS, затем осадите их центрифугированием. Ресуспендируйте осадок в буфере PBS до концентрации 10⁷ клеток/мл.

Используйте пробирку FMO для установления порога сортировки CD25-положительных T-клеток. Согласно данной стратегии гейтирования, сначала установите гейт вокруг фико-отрицательных клеток, чтобы исключить фико-положительные клетки, которые включают моноциты, макрофаги и все остальные CD4-положительные не-T-клетки, как показано на данном рисунке. На отдельном графике определите гейты для CD25-отрицательных и CD25-низких T-клеток, а также для CD25-высоких Treg-клеток, как показано на данном рисунке.

После проведения проточно-цитометрического анализа и сортировки субпопуляций клеток центрифугируйте пробирки для сбора и храните Т-клетки на льду до момента посева. Маркируйте 96-луночный планшет с U-образным дном согласно таблице. В лунки 96-луночного планшета внесите по 50 мкл аликвоты бусинок, покрытых CD3, рассчитав концентрацию из расчета 3 бусинки на одну клетку-респондент на лунку в полной среде с 10% объединенной сыворотки крови человека, затем разведите предварительно облученные APC в среде до концентрации 5×10⁵ клеток/мл.

Добавьте 50 µL клеток в 96-луночный планшет, затем добавьте 2,5 × 10⁴ CD4-положительных CD25-отрицательных или CD4-положительных CD25-низких Т-клеток в каждую лунку в трех повторностях. Добавьте Treg в ряд B и в лунки, помеченные как «только Treg», в кокультуру в соотношении 1:10, как показано здесь. Затем инкубируйте планшет при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 и насыщенной влажностью в течение 72 часов. Далее проведите импульс клеток 1 мкКи тритированного тимидина и продолжите инкубацию при 37 °C в течение следующих 16 часов, чтобы тимидин встроился в последние часы кокультивирования.

Используйте систему сбора клеток Filter Mate для сбора клеток на многоэкранную планшетную пластину для сбора. Затем накройте планшет с собранными клетками прозрачной пластиковой крышкой, предварительно заполненной сцинтилляционной жидкостью. В завершение измерьте количество импульсов в минуту (CPM) для каждой лунки.

С помощью сцинтилляционного счетчика с использованием данной системы можно выделить субпопуляции Т-клеток с высокой степенью чистоты, что видно на следующей серии диаграмм рассеяния (dot plots). Здесь, в нижнем гейте, показаны CD4-положительные CD25-отрицательные Т-клетки. На следующем рисунке представлены высокоочищенные CD4-положительные CD25-низкие Т-клетки. Чистая популяция CD4-положительных клеток, выделенных методом проточной сортировки.

Клетки treg с высоким уровнем экспрессии CD 25 показаны в верхнем контрольном гейте. Монокультуры APC и treg от здоровых доноров демонстрировали незначительную пролиферацию или ее отсутствие по сравнению с фоном, что было определено по включению тимидина, в то время как наивные CD 25-отрицательные и активированные in vivo CD 25-низкие T-клетки демонстрировали выраженную пролиферацию, которая подавлялась при совместном культивировании этих типов клеток-респондеров с клетками treg. При этом наблюдались небольшие различия в способности treg подавлять пролиферацию наивных CD 25-отрицательных и активированных in vivo CD 25-низких T-клеток.

Контроль не был значимым. Монокультуры антигенпрезентирующих клеток (APC) и регуляторных Т-клеток (Tregs), полученные от лиц из группы риска, практически не проявляли пролиферации выше фонового уровня, согласно данным по включению тимидина. В то же время наивные CD 25-отрицательные и активированные InVivo CD 25-низкие Т-клетки демонстрировали более низкие уровни пролиферации по сравнению со здоровым контролем.

Т-респондеры были дополнительно подавлены tregs и совместными культурами, так как данный анализ дает достоверные результаты. Кроме того, можно сделать вывод, что низкие значения CPM указывают на возможные дефекты в передаче сигнала, которые следует дополнительно изучить в рамках другого типа исследования. Однако разница в способности tregs подавлять CD 25-отрицательные по сравнению с CD 25-низкими Т-респондерами у лиц из группы риска была значительной.

После просмотра этого видео вы должны четко представить, как последовательно выполнить все необходимые этапы для проведения успешного и достоверного функционального теста на наличие Tregs у здоровых людей и лиц с нарушением иммунной системы, например, при сахарном диабете 1-го типа.