Биофизические Анализы для исследования механических свойств клеточного ядра Interphase: Субстрат приложений Процедить и микроиглы Манипуляция

Общая цель следующих экспериментов заключается в измерении механических свойств интерфейса клеточного ядра и его физической связи с окружающим цитоскелетом. Это достигается путем приложения механического напряжения к клеткам, высеянным на прозрачную силиконовую мембрану, и визуализации вызванных деформаций ядра. Увеличение ядерных деформаций соответствует снижению жесткости ядра, поскольку изменения в связи между ядром и цитоскелетом также могут влиять на индуцированные деформации ядра.

Передача внутриклеточных сил между цитоскелетом и ядром исследуется путем приложения локального механического напряжения к цитоскелету. Затем регистрируется смещение флуоресцентно меченных ядерных и цитоскелетных структур. Полученные результаты позволяют определить жесткость клеточных ядер относительно окружающего цитоскелета.

На основании экспериментов по деформации субстрата анализ манипуляций с помощью микроигл показывает, что нарушение связи между ядром и цитоскелетом приводит к дефектам передачи внутриклеточных сил. Основным преимуществом этих методов по сравнению с существующими, такими как аспирация изолированных ядер с помощью микропипетки, является то, что они позволяют измерять механические свойства ядер в целом живых клетках, не нарушая нормальную архитектуру клетки. Эти методы могут дать представление о том, как изменения в составе ядерной оболочки могут влиять на механические свойства ядра.

Данный метод также может быть применен для изучения роли механики ядра в контексте таких заболеваний, как нейропатии LA или рак. Каждая чашка для деформации представляет собой изготовленную на заказ пластиковую чашку без дна диаметром три дюйма с пластиковым уплотнительным кольцом для фиксации силиконовой мембраны, которая служит субстратом для культивирования клеток. Для подготовки чашки для деформации зажмите кусок силиконовой мембраны размером четыре на четыре дюйма между уплотнительным кольцом и чашкой, аккуратно обрежьте излишки мембраны, промойте чашку деионизированной водой, а затем подвергните ее автоклавированию перед нанесением молекул внеклеточного матрикса на силиконовую мембрану; отметьте контрольную точку на внешней стороне мембраны в центре нижней части.

Эта метка поможет идентифицировать те же самые клетки во время экспериментов по применению одноосного растяжения. Вокруг контрольной точки наклеивают две параллельные полоски скотча, чтобы ограничить формирование мембраны в одном измерении. Для обеспечения оптимальной адгезии клеток покройте силиконовые мембраны фибронектином в концентрации 3 µg/mL или любыми подходящими белками внеклеточного матрикса.

Накройте чашку с фильтром перевернутой 10-сантиметровой полистирольной чашкой и инкубируйте её в течение ночи при четырех градусах Celsius. На следующий день один раз промойте мембрану раствором PBS, чтобы удалить излишки белка. Налейте в чашку 10 milliliters питательной среды и отставьте в сторону.

После подготовки чашки с покрытой силиконовой мембраной клетки трипсинизируют 0,05% трипсином и высевают адгезивные клетки в чашку в ростовой среде. Эта процедура продемонстрирована на примере эмбриональных клеток мыши.

Фибробласты или мезенхимальные клетки инкубируют от 24 до 48 часов в нормальных условиях культивирования. Инвертированный микроскоп, оборудованный для экспериментов по деформации субстрата, оснащен устройством для растяжения, состоящим из базовой пластины, которая устанавливается на предметный столик микроскопа. На пластине закреплена центральная цилиндрическая платина, которая служит для приложения деформации к центральной части силиконовой мембраны.

Устройство также оснащено подвижной пластиной, удерживающей чашку для растяжения, которая может перемещаться вверх и вниз по четырем направляющим штифтам, а также грузом весом пять фунтов для создания нагрузки. Для визуализации ядер инкубируйте клетки в чашке для растяжения с красителем Hoechst в концентрации 1 мкг/мл в течение 15 минут при 37 °C. После инкубации аспирируйте среду и замените ее 15 мл ростовой среды без фенолового красного с добавлением 25 мМ HEPES.

Затем вкрутите чашку в держатель и осторожно нанесите смазку по периметру нижней части силиконовой мембраны, чтобы обеспечить скольжение мембраны по центральной платине. Убедитесь, что центральная часть мембраны осталась чистой. Установите базовую пластину на предметный столик микроскопа и аккуратно закрепите держатель для чашки на базовой пластине.

Убедитесь, что в исходном состоянии покоя силиконовая мембрана чашки для растяжения свободно лежит на центральной пластине. Затем сфокусируйтесь на нижней стороне силиконовой мембраны и найдите центральную черную контрольную точку. Эта точка будет служить отправной точкой для всех этапов получения изображений и поможет локализовать одни и те же клетки во время и после растяжения.

На этом изображении центральная точка заполняет все поле зрения. Начиная с края точки, отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать клетки и верхнюю часть силиконовой мембраны. Найдите хорошо распластанные клетки с ядрами, расположенными по центру.

Снимите изображение в режиме фазового контраста, сфокусировавшись на контуре клетки и силиконовой мембране. Затем сделайте флуоресцентный снимок окрашивания ядерного крючка, сфокусировавшись на центральной плоскости ядра. После получения изображений от 5 до 15 клеток вернитесь к центральной точке.

Медленно приложите груз к чашке для растяжения, чтобы обеспечить равномерное приложение деформации. В центре чашки. Максимальная приложенная деформация субстрата ограничена нейлоновыми проставками, расположенными на штифтах вертикального выравнивания; после приложения деформации сфокусируйтесь на нижней части силиконовой мембраны и снова найдите контрольную точку, начиная от этой точки.

Снова перейдите к тем же клеткам и повторно получите фазово-контрастные и флуоресцентные изображения каждого ядра клетки при максимальном растяжении, стараясь максимально точно совместить фокальные плоскости с начальными изображениями. Этот процесс не должен занимать более 10 минут, чтобы избежать активного ремоделирования и адаптации клетки к необычному субстрату. После получения всех соответствующих изображений верните предметный столик микроскопа в исходное положение.

Осторожно снимите груз с пластины-держателя чашки и, если необходимо, дайте силиконовой мембране расслабиться. Аккуратно поднимите чашку для центрифугирования до ее исходного положения. Затем настройте фазовый контраст и флуоресценцию.

Изображения клеток после приложения деформации, полученные аналогично изображениям в процессе деформации, а также изображения клеток и флуоресцентно меченных ядер до, во время и после приложения деформации анализируются для вычисления нормированной деформации ядер. В данной демонстрации для анализа используется специально написанный скрипт MATLAB, однако доступны и другие альтернативные варианты для ручного расчета приложенной деформации подложки путем сопоставления положений от трех до шести контрольных точек, расположенных на мембране, между соответствующими изображениями до и после полной деформации. Затем программа MATLAB вычисляет приложенную деформацию мембраны, сравнивая положения соответствующих контрольных точек на изображениях до деформации и при полной деформации.

Также сравниваются положения для определения остаточной деформации между изображениями до и после приложения нагрузки. Контрольные точки одновременно используются для совмещения пар изображений, что помогает обнаружить поврежденные или отслаивающиеся клетки. Затем с помощью отдельной программы MATLAB вручную выберите ядра, чтобы рассчитать деформацию для каждого отдельного ядра.

Это достигается путем сопоставления размера ядра между соответствующими флуоресцентными изображениями до и после деформации или путем сопоставления внутриядерных маркеров для учета небольших различий в приложенной деформации мембраны между разными экспериментами. Результаты выражаются в виде нормированной деформации ядра. Она определяется как отношение индуцированной деформации ядра к приложенной деформации мембраны, рассчитанное для каждого ядра.

Скрипты MATLAB предоставляются лабораторией Lambing по запросу. На заключительном этапе каждое ядро проходит валидацию; измерения из клеток, которые открепились или были повреждены во время приложения деформации, исключаются. ЭМФ, распределенные по двум отдельным областям на силиконовой мембране, были визуализированы с помощью фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии до, во время и после приложения 20% одноосевой деформации; здесь представлен пример успешного эксперимента с валидными ядрами клеток, которые перенесли приложение деформации без повреждений или открепления.

Напротив, клетки, показанные здесь, сжались или частично отслоились в процессе приложения деформации и исключены из анализа. Клетка слева имеет признаки повреждения цитоскелета и коллапса ядра, в то время как клетка справа частично отслаивается и сжимается при приложении деформации. Это может свидетельствовать об избыточной деформации.

Здесь представлен анализ нормализованной деформации ядра в панели различных линий клеток meth мышей с дефицитом Lamin AC, в которых эктопически экспрессируется либо пустой вектор, либо Lamin A дикого типа, в сравнении с клетками однопометных мышей дикого типа. Потеря экспрессии белков ядерной оболочки Lamin AC приводит к увеличению нормализованной деформации ядра. Это свидетельствует о снижении жесткости ядра, которая может быть частично или полностью восстановлена путем повторного введения Lamin A дикого типа. Для подготовки к эксперименту с манипуляциями с помощью микроиглы инкубируйте чашку для культивирования клеток с стеклянным дном диаметром 35 мм с низкой концентрацией фибронектина в течение двух часов при 37 °C; после инкубации дважды промойте чашку раствором HBSS и добавьте в нее 2 мл ростовой среды.

Затем эмбриональные фибробласты мыши подвергают трипсинизации с использованием 0,05% трипсина и высевают в ростовой среде на планшет с и glass-bottom, покрытый фибронектином, в двух миллилитрах ростовой среды. Чтобы получить отдельные адгезивные неконфлюэнтные клетки, поместите клетки обратно в инкубатор на ночь; для окрашивания клеток добавьте в ростовую среду краситель для митохондрий MitoTracker и краситель для ядер Hoechst. Добавьте эту ростовую среду к клеткам, после чего проведите инкубацию.

Затем промойте клетки, инкубируя их в сбалансированном солевом растворе Хэнкса в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого добавьте к клеткам для визуализации ростовую среду без фенолового красного с содержанием HEPES 25 мМ.

Для проведения эксперимента с микроиглами установите предварительно вытянутую микроиглу в микроманипулятор, подключенный к инвертированному микроскопу с цифровой камерой на приборе с присоединенным зарядом (ПЗС). Сфокусируйте микроиглу рядом с отдельной клеткой. Получите одно изображение отдельной клетки до введения микроиглы в цитоскелет.

В режиме фазового контраста получите одно флуоресцентное изображение окрашивания Hoechst 33342 и одно флуоресцентное изображение окрашивания митохондрий с использованием объектива 60x на инвертированном микроскопе. С помощью микроманипулятора осторожно введите микроиглу в цитоплазму клетки на фиксированном расстоянии от периферии ядра, затем сделайте одно изображение в фазовом контрасте, одно флуоресцентное изображение окрашивания Hoechst 33342 и одно флуоресцентное изображение окрашивания митохондрий. Переместите микроиглу на определенное расстояние по направлению к периферии клетки со скоростью 1 мкм/с, используя управляемый компьютером микроманипулятор, при автоматическом получении изображений каждые 10 секунд.

По мере перемещения микроиглы на определенное расстояние к периферии клетки, управление микроманипулятором должно осуществляться с помощью компьютера для обеспечения стабильности микроманипуляций. Завершающим этапом процедуры является получение изображений после извлечения микроиглы; затем анализируются изображения флуоресцентно меченных структур ядра и цитоскелета, полученные до, во время и после манипуляций с микроиглой, для расчета смещения небольших внутриклеточных областей. В данной демонстрации для анализа используется специально написанный скрипт MATLAB, однако доступны и другие варианты.

Скрипт MATLAB для измерения смещения, создаваемого микроиглой, можно получить в лаборатории Ламбинга по соответствующему запросу. Программа MATLAB использует алгоритм нормализованной взаимной корреляции для вычисления сдвига между исходным положением флуоресцентно меченых объектов и их новым определенным положением. Результаты смещения затем отображаются в виде векторных карт и сохраняются в виде числовых значений.

Следующий шаг заключается в использовании полученных карт векторов смещения для определения среднего смещения внутри цитоскелета или ядра с помощью программы Matlab. Сначала выберите три или более точек внутри цитоскелета в месте приложения деформации. На карте векторов смещения вычислите среднее числовое значение, чтобы определить величину деформации цитоскелета вблизи места приложения, возникшую в процессе использования микроиглы.

Затем выберите три или более точек в ядре рядом с местом приложения деформации и вычислите среднее значение. Это значение представляет собой величину деформации ядра вблизи места воздействия микроиглы. Используя тот же метод, определите деформацию ядра и цитоскелета вдали от места приложения деформации, выбрав точки в соответствующих областях.

Для измерения передачи внутриклеточных сил был проведен анализ с использованием микроиглы. Здесь представлены изображения в фазовом контрасте и флуоресцентные изображения фибробласта, окрашенного синим красителем для ядер и зеленым красителем MIT tracker для митохондрий. Микроигла была введена в цитоскелет на определенном расстоянии от ядра и затем перемещена к периферии клетки.

Смещение митохондрий отслеживали до, во время и после нагрузки на цитоскелет, затем результаты смещения представляли в виде векторов. Каждый вектор соответствует смещению, рассчитанному как разница между исходным положением и newly identified position. Области с низкой интенсивностью изображения или недостаточной текстурой исключались из анализа.

Затем количественно оценивали смещение цитоскелета и ядра в выбранных областях на возрастающем расстоянии от места приложения деформации как для контрольных фибробластов, так и для фибробластов. При сохранной связи между ядром и цитоскелетом силы передаются через всю клетку, что приводит к индуцированной деформации ядра и цитоскелета, которая медленно затухает по мере удаления от места приложения деформации. Напротив, в клетках с нарушенной связью между ядром и цитоскелетом наблюдается локализованное смещение вблизи места приложения и лишь незначительная индуцированная деформация на большем удалении.

Сравнимое приложение деформации цитоскелета в месте введения микроиглы наблюдается как для контрольных фибробластов, так и для фибробластов с нарушенной связью между ядром и цитоскелетом. Однако индуцированное смещение ядра и цитоскелета в других областях было значительно меньше в фибробластах с нарушенной связью между ядром и цитоскелетом, чем в контрольных клетках. Таким образом, уменьшение смещения цитоскелета и ядра по мере удаления от места приложения деформации указывает на то, что принудительная передача сигнала между цитоскелетом и ядром была нарушена.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как измерять механику ядра и передачу внутриклеточных сил между ядром и цитоскелетом. Эти методы можно использовать для изучения влияния мутаций в белках ядерной оболочки или изменений состава ядерной оболочки, происходящих в процессе развития или при раке.