Сопоставление ингибирующих нейронов схем с Фотостимуляция лазерного сканирования

Общая цель данной процедуры заключается в исследовании локальной функциональной организации тормозных нейронных цепей. Процедура начинается с подготовки живых срезов мозга из первичной соматосенсорной коры мышей. Следующим этапом является визуализация и регистрация активности целевых типов тормозных клеток, экспрессирующих GFP, в срезе мозга.

После проведения данной лазерной сканирующей фотостимуляции с помощью глутамата используется метод фотодеблокирования для активации небольших кластеров пресинаптических нейронов в качестве возбуждающих или тормозных. Постсинаптические токи регистрируются в экспрессирующих GFP интернейронах. Заключительный этап включает фотостимуляцию, анализ данных и построение количественных карт синаптических входов в регистрируемые нейроны.

В конечном счете, лазерное сканирующее фотостимулирование в сочетании с регистрацией потенциалов всего нейрона позволяет constructing подробные карты синаптических входов в специфические типы тормозных нейронов, что может помочь в определении организации и функции локальных тормозных цепей коры головного мозга. Метод фотостимуляции был разработан доктором Ларри Катцем и Недом Кэллоуэем, а затем усовершенствован доктором Кэролс Вабодой, моим научным руководителем доктором Синг Цзе, который обучался у доктора Кэллоуэя в Институте Солка, где он руководил многими исследованиями интернейронных цепей. В настоящее время наша группа расширяет и продолжает эти исследования, изучая интернейронные цепи.

Для начала данной процедуры проведите эвтаназию трансгенной мыши в возрасте двух-трех недель после рождения путем декапитации и быстро извлеките мозг, поместив его в охлажденный и насыщенный кислородом раствор для срезания. Затем с помощью GFP-очков проведите визуальный скрининг мозга для проверки экспрессии GFP. Далее с помощью вибратома нарежьте первичную соматосенсорную кору на срезы толщиной 400 micrometer.

Инкубируйте срезы в растворе A CSF с сахарозой, насыщенном смесью 95% O2 и 5% CO2, при температуре 32 °C в течение от 30 минут до одного часа. После этого перенесите срезы в обычный раствор A CSF при комнатной температуре; в это время подготовьте лазер к эксперименту, включите систему охлаждения лазера и блок питания. Затем включите всё оборудование для управления фотостимуляцией, включая систему сканирующих зеркал, оптический модулятор, электронный затвор и входной усилитель фотодиода.

Затем включите электрофизиологическое оборудование, такое как усилитель Multi Clamp 700 B и микроманипуляторы. Электрофизиологические записи, фотостимуляция и визуализация проводятся в камере для перфузии срезов, установленной на моторизованном предметном столике микроскопа. После этого включите камеру визуализации; срез будет отображаться в вертикальном микроскопе с инфракрасным DIC-контрастом и эпифлуоресцентной оптикой через систему визуализации.

Затем откройте на мониторе программное обеспечение для FS на базе MATLAB и программное обеспечение для камеры Q capture. Перед началом эксперимента проверьте систему лазерной фотостимуляции и убедитесь, что она находится в рабочем состоянии. Поместите лист бумаги под микрообъектив с четырехкратным увеличением, чтобы наблюдать за шаблоном сканирования лазера во время работы системы.

Для изготовления микроэлектрода с сопротивлением от четырех до шести МОм вытяните стеклянный электрод с помощью вытягивателя пипеток. Затем заполните электрод внутренним раствором, содержащим 0,1% биотина, для маркировки клеток и морфологической идентификации. После этого включите систему перфузии под давлением, чтобы подать CSF в камеру.

Обеспечьте постоянный уровень жидкости 2,0 мм над срезом в камере. Аликоту стокового раствора MNI-заблокированного глутамата добавьте к 25 мл циркулирующего A CSF для достижения концентрации заблокированного глутамата 0,2 мМ. Затем перенесите один срез мозга в регистрационную камеру.

Запустите систему визуализации, чтобы проверить качество среза и анатомически локализовать первичную соматосенсорную область. Затем зафиксируйте срез с помощью специально изготовленного платинового кольца с нитями, стараясь не располагать фиксатор над областью мозга, предназначенной для записи. Визуализируйте клетки с помощью объектива 60x, основываясь на экспрессии GFP под дифференциально-интерференционным (DIC) флуоресцентным микроскопом.

Идентифицируйте и выберите ингибиторные типы клеток. Обратите внимание, что регистрация будет проводиться под визуальным контролем с помощью инфракрасного дифференциально-интерференционного контраста (DIC). Видеомониторинг и переключение между режимами DIC и флуоресценции необходимы для подтверждения местоположения GFP-клетки при опускании электрода к целевой клетке.

Используйте стандартный метод локальной фиксации потенциала (patch clamp). Сначала подайте положительное давление на электрод. Подведите его близко к поверхности клетки, чтобы создать заметное углубление на мембране целевой клетки.

Затем быстро создайте отрицательное давление для формирования гигаомного контакта и прорыва мембраны клетки, контролируя ответы на инъекцию тока по видеомонитору. После прорыва мембраны сделайте снимки зарегистрированного экспрессирующего GFP интранейрона при 60-кратном увеличении в режимах DIC и флуоресценции для онлайн-верификации. Перед сбором данных фотостимуляции введите гиперполяризующие и деполяризующие импульсы тока, чтобы изучить основные электрофизиологические свойства каждой клетки.

После достижения стабильной регистрации от всей клетки с хорошим сопротивлением доступа, которое обычно составляет менее 20 МОм, переключите объектив микроскопа с 60-кратного на 4-кратное увеличение для лазерного сканирующего фотостимулирования, получите изображение среза при 4-кратном увеличении и используйте его для наведения и регистрации мест фотостимуляции. Установите параметры фотостимуляции и сбора данных, активировав модуль конфигурационного переключателя phys. Используйте лазерный импульс длительностью 1 мс и мощностью около 20 мВт с интервалом стимуляции 1 с.

Для картирования с помощью фотостимуляции зарегистрируйте данные в виде трейсов продолжительностью одна секунда с частотой дискретизации 10 килогерц. Затем загрузите изображение среза 4x в модуль картирования программы phys. Определите положение сомы и настройте участки фотостимуляции в виде паттерна 16 на 16 с размером каждого участка 80 мкм на 80 мкм.

Расстояние вокруг местоположения клетки, охватывающее все слои коры. Затем картируйте профиль возбуждения зарегистрированного нейрона, анализируя локализацию спайков в ответ на фотостимуляцию в режиме фиксации тока (current clamp). Наше удобное программное обеспечение с функциями онлайн-отображения облегчает проведение экспериментов по картированию.

После этого картируйте связи локальной возбуждающей цепи, регистрируя возбуждающие постсинаптические токи в исследуемой клетке. При лазерном сканировании различных участков удерживайте потенциал клетки на уровне -70 мВ в режиме voltage clamp для детектирования входящих возбуждающих токов. Затем повторите картирование возбуждающих постсинаптических токов два-три раза, изменив паттерн фотостимуляции путем поворота или зеркального отражения. Для картирования связей локальной тормозной цепи регистрируйте тормозные постсинаптические токи в исследуемой клетке.

В данном случае поддерживайте потенциал клетки близким к нулю, а именно -15 мВ в режиме фиксации потенциала (voltage clamp), чтобы зарегистрировать выходящие тормозные токи. После завершения всех физиологических анализов осторожно извлеките электрод из регистрируемой клетки. Извлеките срез мозга из камеры, затем зафиксируйте его в 4% параформальдегиде на ночь и проведите окрашивание зарегистрированных клеток на биотин.

В данном эксперименте для классификации тормозных нейронов используется сочетание экспрессии GFP, собственных электрофизиологических и морфологических характеристик. Представлены пример и карта необработанных данных, иллюстрирующие лазерную сканирующую фотостимуляцию, которая позволяет провести детальное картирование локальных связей кортикальной цепи с регистрируемым тормозным нейроном. Приведены примеры количественных карт входных сигналов с цветовой кодировкой, полученных на основе необработанных трасс, показанных на Рисунке D. Амплитуды синаптических событий, зафиксированные в регистрируемом интернейроне, закодированы цветом и топографически наложены на места фотостимуляции.

Расположение тела клетки обозначено красным незакрашенным кругом на масштабной линейке. Теплые цвета указывают на сильные синаптические входы, а холодные — на слабые или отсутствие связей с целевой клеткой. Аналогичным образом, на рисунке E представлено количество синаптических событий на каждую точку выборки фотодеблокирования для регистрируемого нейрона.

На рисунке F показано время наступления первого зафиксированного синаптического события в регистрируемой клетке после фотостимуляции (масштаб указан на масштабной линейке). Теплые цвета соответствуют короткому времени задержки входного сигнала, а холодные цвета — более длительным синаптическим задержкам. Таким образом, метод LSPS позволяет создавать детальные карты расположения, силы, латентности и количества входов, воздействующих на определенные типы тормозных нейронов.

При выполнении данной процедуры важно проявлять терпение, обеспечивать чистоту условий эксперимента, а также эффективно и очень осторожно переключать нейрон с высокого увеличения на низкое. Затем следует надлежащим образом использовать специализированное программное обеспечение.