Дифференцировка нервных стволовых клеток человека в нейроактивные и астроцитарные предшественники

Начнем с неадгезивных нейросфер, трехмерного агрегата нервных стволовых клеток человека в кондиционированной среде, полученной из клеточной культуры.

Эта среда содержит питательные вещества, факторы роста и компоненты внеклеточного матрикса, которые поддерживают жизнеспособность клеток.

Центрифуга для сбора нейросфер.

Обработайте их ферментами трипсином и ДНКазой, смешайте содержимое, а затем инкубируйте.

Трипсин нарушает межклеточную адгезию и способствует отслоению клеток, в то время как ДНКаза разрушает свободную ДНК, предотвращая слипание клеток.

Многократно пипетируйте содержимое до образования одноклеточной суспензии. Затем добавьте ингибитор трипсина, чтобы нейтрализовать активность фермента.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте клетки в пролиферирующей среде, содержащей нервные факторы роста.

Поместите клеточную суспензию на покровное стекло с полимерным покрытием, помещенное в многолуночный планшет. Инкубируйте для присоединения стволовых клеток к полимеру.

Далее, на основе абсорбции специфических факторов роста, стволовые клетки дифференцируются в нейральные и астроцитарные предшественники, которые готовы к дальнейшему созреванию в специализированные типы клеток.

После подготовки питательной среды и осаждения нервных стволовых клеток человека в соответствии с текстовым протоколом извлекают из инкубатора колбу с клетками, которые необходимо пройти, и вносят ее в шкаф биобезопасности или БСК. Осторожно наклоните колбу, позволяя ячейкам опуститься на дно скопившейся среды.

Перелейте 10 миллилитров среды двумя порциями по 5 миллилитров в чистую 15-миллилитровую пробирку с маркировкой «CM» для кондиционированной среды. Следите за тем, чтобы не аспирировать ни одна из клеток, осевших в колбе. Перенесите 3 миллилитра среды из пробирки КМ в 15-миллилитровую пробирку с надписью «раствор ингибитора трипсина». Затем отложите трубку CM в сторону.

Далее извлеките 5 миллилитров среды и клеток, оставшихся в колбе Т75, и поместите их в чистую 15-миллилитровую пробирку с надписью «клетки». Затем с помощью серологической пипетки и 3,5-миллилитровых объемов КМ дважды промыть колбу Т75, перенеся промывку КМ в трубку «клетки». Это удалит все нейросферы из колбы Т75.

Центрифугируйте пробирку «клетки» при 100-кратном g при комнатной температуре в течение пяти минут. Пока клетки вращаются, получите заранее приготовленный раствор глюкозы DPBS на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и добавьте соответствующее количество трипсина и ДНКазы.

После того, как трубка «клетки» перестанет вращаться, удалите всю кондиционированную жидкость для надосадочной жидкости и перенесите ее в трубку КМ. Добавьте раствор трипсина в клеточную гранулу в 15-миллилитровую пробирку и используйте 5-миллилитровую пипетку для пипетки вверх и вниз примерно от 5 до 10 раз. Закройте крышку трубки, и выдержите ее на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

В пробирку ингибитора трипсина добавьте соответствующий объем ингибитора трипсина, добавив тот же объем раствора, который использовался для раствора трипсина. Затем поместите раствор ингибитора трипсина на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока это не понадобится.

После инкубации пипетируйте клетки вверх и вниз от 5 до 10 раз. Затем инкубируйте образец на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия еще 10-15 минут. После инкубации клеток пипетируйте клетки вверх и вниз до тех пор, пока сферы полностью не диссоциируют. Затем сразу же добавьте раствор ингибитора трипсина, и пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз 10 раз.

Чтобы подсчитать количество клеток в суспензии, нанесите пипеткой 15 микролитров пресмеси трипанового синего на небольшую весовую лодочку, и добавьте 5 микролитров клеточной суспензии. Перемешайте пипеткой вверх и вниз от 3 до 5 раз. Затем перенесите 10 микролитров трипановой суспензии голубых клеток на обе стороны гемоцитометра, накрытого стеклянным покровным стеклом.

Понаблюдайте за клетками под световым микроскопом и подсчитайте общее количество клеток в каждой из четырех угловых сеток. Затем сложите эти числа вместе. После расчета количества ячеек по текстовому протоколу добавьте объем клеточной суспензии в каждую колбу Т75, чтобы получить 5 х 10⁶ клеток на колбу.

Если объем меньше 5 миллилитров, добавьте дополнительно кондиционированную среду до 5 миллилитров. Затем добавьте в колбу 10 миллилитров новой среды DFHGFPS, содержащей факторы роста. Убедитесь, что на колбе указан тип ячеек, даты, количество ячеек в колбе и номер прохода. При желании инкубируйте клетки на этом этапе.

Чтобы наложить адгезивные HNSC, за день до прохождения очистите BSC, как описано в текстовом протоколе, и с помощью щипцов поместите одиночные стерильные 12-миллиметровые стеклянные покровные стекла в лунки 24-луночного планшета. Покройте лунки покровными стеклами по 250 микролитров на лунку 0,01% поли-D-лизина или PDL в стерильной воде и инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Удалите PDL из лунок, а затем покройте их 1 микрограммом на квадратный сантиметр ламинина DPBS.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Если на следующий день в этом нет необходимости, оберните парапленку вокруг краев тарелки, чтобы запечатать ее, и храните при температуре 4 градуса Цельсия. Удалите излишки раствора ламинина из лунок с помощью аспирации и используйте 0,5 миллилитра DPBS для промывки лунок один раз. Затем засейте клетки в каждую лунку с плотностью от 0,6 до 1 х 10⁵ клеток на квадратный сантиметр.