Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании клеточных микроокружений для изучения биологических вопросов, касающихся поведения отдельных клеток и групп клеток, которое происходит на микро- и наноразмерном уровнях. Это достигается путем первоначального проектирования шаблонов, которые в конечном итоге будут определять расположение клеток. Затем эти проекты переносятся на поверхности в виде паттернов с помощью фотолитографии, что позволяет создавать формы для плазменного экранирования методом мягкой литографии.

Наконец, эти экранирующие формы располагают в чашке Петри в виде штатива, чтобы обеспечить селективное воздействие плазмы на лежащие ниже поверхности, что создаст химический рисунок, чувствительный к клеткам, на участках под каждой формой. В результате можно получить данные, демонстрирующие, как поведение клетки зависит от её микроокружения и взаимодействия с соседними клетками. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы о влиянии микроокружения на поведение клеток, например, о том, как взаимодействия между группами клеток влияют на феномены более высокого порядка.

И каким образом субклеточные наноразмерные сигналы влияют на такие функции, как миграция и дифференцировка здоровых клеток? Сначала с помощью суперклея прикрепите предметное стекло с паттерном к стопке пустых предметных стекол. Затем сделайте из алюминиевой фольги контейнер, который будет немного больше стопки стекол и достаточно велик, чтобы вместить 30 грамм полидиметилсилоксана или PDMS.

Поместите стопку предметных стекол в контейнер, затем залейте стопку PDMS для создания первичной формы. После этого удалите пузырьки воздуха из PDMS, поместив контейнер в вакуумную камеру. Разрушьте имеющиеся в PDMS пузырьки, несколько раз быстро прикрывая и открывая пальцем трубку впускного клапана, чтобы кратковременно допустить подачу воздуха в камеру.

Клапан закрывают на пять минут для непрерывного дегазирования. Затем оставляют PDMS для отверждения в чистом ламинарном шкафу при комнатной температуре на один-два дня. После отверждения PDMS отделяют от мастер-формы, в результате чего получается отливка.

Затем влейте в мастер-форму тонкий слой двухкомпонентного эпоксидного состава массой шесть граммов, который был перемешан в течение одной минуты. Немедленно удалите пузырьки воздуха из эпоксидной смолы, используя несколько циклов дегазации, до того как состав затвердеет. После того как дегазированная эпоксидная смола постоит в покое один час, она частично полимеризуется.

Добавьте в форму больше эпоксидной смолы без дегазации, чтобы получить более толстую структуру, с которой будет удобнее работать на последующих этапах. Затем оставьте эпоксидную смолу отверждаться на один-два дня. После отверждения извлеките эпоксидную форму из мастер-формы из PDMS, затем оберните эпоксидную форму лентой, чтобы создать контейнер.

Затем можно создать рабочую форму, вылив PDMS на эпоксидную форму, удалив пузырьки воздуха из PDMS и подвергнув новую форму отверждению в течение одного-двух дней. После отверждения рабочей формы отделите ее от эпоксидной основы и поместите обе формы в чашки Петри, которые следует хранить в герметичном пластиковом контейнере внутри ламинарного шкафа для поддержания чистоты. Для подготовки формы к созданию поверхностного микрорельефа разрежьте рабочую форму на небольшие секции с помощью лезвия бритвы и поместите эти секции в чашку Петри.

Положения этих секций формы отмечают на обратной стороне чашки Петри перманентным маркером, обводя контуры мест расположения секций; из секций формируют штатив и прижимают его, чтобы обеспечить плотный контакт между рабочей формой и поверхностью чашки Петри. Осмотрев дно чашки, подтверждают правильность размещения по наличию каналов, которые видны невооруженным глазом или с помощью небольшой увеличительной линзы. Помещают всю сборку в плазменную камеру.

Начните обработку плазмой после завершения подготовки к ней. Извлеките форму и систему грузов, затем поместите чашку Петри в бокс биологической безопасности под УФ-излучение на 10 минут для стерилизации. Храните чашку там до момента посева клеток.

Разбавьте выбранные экспериментальные клетки в стандартной культуральной среде для достижения желаемой степени конфлюэнтности. При помещении на поверхность структурированной чашки Петри налейте в нее три миллилитра клеточного раствора. Инкубируйте структурированную чашку Петри при 37 °C, 5% carbon dioxide и 100% влажности от нескольких часов до нескольких дней, чтобы клетки могли собраться в соответствии с паттерном, созданным плазменным электродом.

Правильность формирования паттерна проверяют с помощью фазово-контрастной микроскопии. При культивировании клеток нейробластомы ежедневно добавляют 10 µM ретиноевой кислоты до тех пор, пока не будет наблюдаться дифференцировка клеток в нейроноподобное состояние. Стандартную среду для культивирования клеток заменяют каждые три-четыре дня.

Типичным результатом применения метода плазменной литографии является формирование паттерна из клеток, который повторяет произвольную или природную структуру. Пример этого представлен на данной фигуре, где нейроны, дифференцированные с помощью ретиноевой кислоты, расположены вдоль паттерна из линий. А здесь, на этой фигуре, показаны созданные линии и сети нейронов; кроме нейронов, могут быть использованы и другие типы клеток, что видно на следующих двух фигурах: эта фигура демонстрирует эндотелиальные клетки пупочной вены человека, а эта фигура показывает клетки скелетных мышц C2C12, формирующие сетки, как показано здесь.

Такие материалы, как полилизин, также могут быть нанесены в виде паттернов для облегчения прикрепления определенных типов клеток и для других целей. После выполнения данной процедуры можно внедрить дополнительные элементы, такие как микрофлюика, зондирование клеток или генетическая модификация специфических белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как комбинации стимулов влияют на поведение отдельных клеток и их коллективное поведение?