Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов
13 ноября 2011 г.
Профилирование экспрессии РНК в отдельных областях мозга мыши требует точной и воспроизводимой стратегии сбора тканей. В данной работе описывается протокол, сочетающий корональное секционирование мозга и микродиссекцию с использованием просекателя тканей. Выход и качество суммарной РНК, полученной из соответствующих образцов, подтверждают эффективность изложенного метода.
Общая цель данной процедуры заключается в сборе тотальной РНК из отдельных ядер мозга воспроизводимым, стабильным, экономически эффективным и свободным от РНКаз способом. Это достигается путем предварительного создания рабочей среды, свободной от РНКаз, и извлечения всего головного мозга из обезглавленной мыши. Затем с помощью микротомного токового резака (tissue chopper) нарезают серийные срезы ткани однообразного размера.
Затем интересующие области мозга подвергаются микродиссекции с использованием тканевого керна заданного диаметра, при этом ткань поддерживается в среде, свободной от РНК. В завершение из вырезанных ядер мозга выделяют общую РНК. В итоге можно получить результаты, подтверждающие достаточный выход и качество общей РНК для последующего приготовления библиотеки кДНК и профилирования транскриптома с помощью спектрофотометрического или флуориметрического анализа.
Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как макроанатомическое выделение или эксцизия областей мозга с помощью лазерного микрозахвата, заключается в возможности воспроизводимого и экономически эффективного сбора нескольких отдельных интересующих областей мозга из мозга одной мыши. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, могут ли определенные профили экспрессии транскриптов в областях мозга, не связанных с нейронными цепями, коррелировать с определенными поведенческими чертами, реакциями на окружающую среду и/или патологическим состоянием. Для подготовки к микродиссекции добавьте в 100 миллилитров сбалансированного солевого раствора Эрла (EBSS) 0,44 грамма бикарбоната натрия и 0,884 грамма глюкозы.
Обработайте EBSS 0,1 миллилитром DEPC в автоклавируемом флаконе или колбе с завинчивающейся крышкой в течение не менее 12 часов при 37 градусах Цельсия. Поместите стеклянные пипетки длиной пять и три четверти дюйма в стеклянный стакан объемом один литр, а художественные кисти щетиной вверх — в стеклянный мерный цилиндр объемом 100 миллилитров.
Добавьте достаточное количество воды, обработанной DEPC, чтобы полностью покрыть пипетки и кисточки. Накройте стакан и мерный цилиндр алюминиевой фольгой и инкубируйте не менее 12 часов при 37 °C. После 12-часовой инкубиции с DEPC подвергните все обработанные материалы нагреву до температуры выше 100 °C в течение не менее 15 минут. Охладите EBSS до комнатной температуры перед хранением при 4 °C.
Слейте DD H2O из стакана и мерного цилиндра и продолжайте инкубировать их при температуре выше 100 °C до полного высыхания материалов. Извлеките их из инкубатора, охладите до комнатной температуры и храните для последующего использования. В день проведения эксперимента обработайте все рабочие поверхности для удаления загрязнений РНК, поместите EBSS в водяную баню, установленную на 40 °C, и выдержите там для буферизации и оксигенации.
Насытьте EBSS 5% CO2 и 95% кислородом, поместив газовую трубку в пастер pipette, свободную от РНК. Вставьте пипетку в EBSS и закройте отверстие контейнера с EBSS. Подготовьте томограф (слайсер тканей) для серийного секционирования ткани мозга.
Обработайте верхнюю и нижнюю поверхности прибора для нарезки тканей. Чтобы удалить загрязнения РНК, прикрепите прямоугольный кусочек фильтровальной бумаги Whatman № 4 к поверхности из плексигласа томиграфа. Установите двустороннее лезвие бритвы на рычаг томиграфа.
Установите микрометр на ноль и отрегулируйте минимальную высоту рычага прерывателя так, чтобы лезвие бритвы прорезало фильтровальную бумагу, но не затрагивало плексигласовую пластину. Соберите все дополнительные материалы, необходимые для микродиссекции, включая свободные от РНК чашки для культивирования клеток размером 60 на 15 мм, наконечники для микропипеток на 200 мкл, свободные от РНК, изогнутые ножницы, сухой лед и пробирки для сбора тканей. Поместите пробирки на сухой лед после декапитации мыши с помощью гильотины для грызунов и извлечения всего мозга с сохранением заднего мозга и зрительных нервов.
Поместите мозг в верхнюю часть чашки для культивирования клеток размером 60 x 15 мм, не содержащей РНКаз. Затем перенесите её на рабочую поверхность для отбора проб тканей. С помощью пипетки, не содержащей РНКаз, осторожно увлажните фильтровальную бумагу, закрепленную на тканевом измельчителе, раствором EBSS.
Увлажните ткань мозга EBSS. Перенесите мозг в тканевый чоппер и расположите его так, чтобы вентральная поверхность лежала на фильтровальной бумаге. Срединная линия должна быть перпендикулярна лезвию чоппера, а ростральный край мозга должен прилегать к лезвию.
Используйте кисть для рисования, обработанную A-D-E-P-C, чтобы зафиксировать мозг, осторожно надавливая на его дорсальную поверхность. Поднимите рычаг держателя лезвия примерно на четыре-пять сантиметров над поверхностью дорсальной ткани и удерживайте его в этом положении. Уберите кисть с поверхности мозга и установите значение 750 micrometers.
Использование микрометра. Опустите рычаг, чтобы отсечь ткань и создать корональный срез толщиной 750 µm, при этом лезвие чоппера должно оставаться неподвижным. Используя перекатывающие движения художественной кисти, аккуратно смахните срез ткани с поверхности лезвия.
Немедленно поместите срез ткани в оксигенированный EBSS в чашку Петри. Данный срез теперь готов к микродиссекции. Повторяйте процедуру срезания до получения серийных срезов мозга по всей рострокаудальной плоскости для проведения микродиссекции.
Сначала проверьте освещение, чтобы убедиться, что подсветка образца не будет перекрыта. Отрегулируйте подачу и поток смеси O2 CO2 для поддержания буферизированной оксигенированной среды для ткани. В ходе процедуры определите корональный срез мозга, содержащий интересующую область, и с помощью художественной кисти расположите его горизонтально на дне чашки Петри.
Выберите пробойник для тканей соответствующего диаметра. Придержите корональный срез ткани с помощью художественной кисти и опустите режущий край пробойника на поверхность среза. Прикладывая давление, прорежьте срез ткани пробойником, плотно прижав его к дну чашки Петри.
Совершайте вращательные движения, чтобы убедиться, что исследуемая область была отделена от окружающей ткани. Осторожно приподнимите столбик ткани над срезом и с помощью художественной кисти освободите микропанч, чтобы он плавал в EBSS. Немедленно поместите микропанч ткани в пробирку для стабильного хранения при −80 °C, находящуюся на сухом льду.
Ткань должна легко прилипнуть к стенке пробирки. Поместите пробирку с образцом микродиссекции обратно в сухой лед. Повторите процедуру микродиссекции для каждого интересующего отдела мозга.
После завершения микродиссекции запишите соответствующую маркировку или штрихкоды для каждой пробирки с образцом. Поместите образцы тканей в морозильную камеру при температуре -80 °C до начала экстракции РНК из образцов тканей. Сначала подготовьте рабочую зону, свободную от РНК.
Приготовьте достаточное количество смеси магнитных частиц и лизирующего связывающего раствора согласно инструкции к набору для выделения тотальной РНК. Извлеките образцы тканей из морозильной камеры при -80 °C и поместите пробирки непосредственно на сухой лед. Добавьте 100 µL лизирующего связывающего раствора в пробирку с образцом.
Прикрепите к пеллет-миксеру пестик, подходящий для пробирок объемом 0,5 мл, и гомогенизируйте ткань, используя наконечник для пипеты с низким уровнем удерживания, свободный от нуклеаз. Немедленно перенесите гомогенизированный образец в лунку round-bottom 96-луночного планшета для культивирования тканей, используя наконечник того же типа. Добавьте в образец 60 µL 100% изопропанола.
Добавьте 20 µL смеси бусин к образцу и перемешайте, выполнив аспирацию и подачу раствора пипеткой три-четыре раза. Следуйте инструкциям протокола набора для выделения общей РНК, чтобы завершить экстракцию общей РНК. В завершение измерьте чистоту и концентрацию полученной общей РНК. Данные по общей РНК, выделенной из микропробок различных отделов мозга, представлены в этой таблице.
Образцы РНК, элюированные 30 µL буфера для элюции, содержали достаточное количество общей РНК для использования с имеющимися в продаже наборами для подготовки кДНК для секвенирования РНК. Кроме того, выход РНК и значения соотношения 260/280 представляют собой единичные показатели, полученные из соответствующих образцов микродиссекции для демонстрации данных по каждой области мозга, и они подтверждают высокую чистоту образцов. После освоения данной методики ее выполнение занимает от 8 до 10 минут при условии соблюдения всех правил. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости минимизировать риск контаминации рабочих поверхностей или образцов тканей РНК, используя только безнуклеазные или обработанные DEPC материалы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается протокол профилирования экспрессии РНК в отдельных областях мозга мыши, при этом особое внимание уделяется стратегии точного и воспроизводимого сбора тканей. Метод сочетает в себе корональное секционирование мозга с микродиссекцией с помощью просекателя тканей для получения высококачественной тотальной РНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Молекулярная биология
- РНК-профилирование
Теоретические сведения
- Профилирование экспрессии РНК имеет решающее значение для понимания функций мозга.
- Отдельные ядра мозга требуют тщательного препарирования для обеспечения точности анализа.
- Поддержание среды, свободной от РНказ, необходимо для сохранения целостности РНК.
- Предыдущим методам не хватало согласованности и воспроизводимости.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол экстракции РНК из различных отделов мозга мыши.
- Обеспечить высокий выход и качество РНК для последующего использования в анализах.
- Облегчить профилирование транскриптома за счет применения улучшенных методов сбора тканей.
Используемые методы
- Подготовка рабочей среды, свободной от РНказ.
- Декапитация и извлечение всего головного мозга мыши.
- Равномерное секционирование ткани мозга с помощью тканевого резака с микрометрическим управлением.
- Микродиссекция целевых областей мозга с использованием тканевого керна в среде, свободной от РНК.
Основные результаты
- Из выделенных ядер мозга была получена высокая концентрация суммарной РНК.
- Качество РНК было подтверждено как подходящее для подготовки библиотеки кДНК.
- Результаты подтверждают применимость данного метода для профилирования транскриптома.
- Анализы продемонстрировали достаточное качество РНК для последующих приложений.
Выводы
- Описанный протокол представляет собой надежный подход к экстракции РНК.
- Он повышает согласованность и качество образцов РНК из областей мозга мыши.
- Данный метод будет полезен для будущих нейробиологических исследований, включающих анализ РНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный подход к микродиссекции обеспечивает воспроизводимое и высокоэффективное выделение тотальной РНК из отдельных областей мозга мыши, устраняя основное препятствие в валидации мишеней для нейробиологии, когда низкий выход РНК при лазерной микродиссекции затрудняет профилирование транскриптома. Обеспечивая стабильное качество РНК, подходящее для секвенирования следующего поколения, этот метод способствует механистическому снижению рисков при работе с мишенями ЦНС и повышает прогностическую достоверность на ранних этапах рабочих процессов по поиску новых лекарственных средств. Он представляет собой масштабируемую и экономически эффективную альтернативу для исследований экспрессии генов в специфических областях мозга при доклинической оценке мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения РНК из конкретных ядер мозга для сопоставления экспрессии транскриптов с функцией нейронных цепей и поведенческими фенотипами.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимый и экономически эффективный сбор образцов из нескольких отдельных областей мозга одной мыши, что сокращает количество используемых животных и повышает пропускную способность при оценке рисков целевых молекул.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает выделение тотальной РНК с выходом и чистотой, достаточными для последующего проведения RNA-Seq и qRT-PCR, что позволяет надежно разрабатывать методы анализа для скрининга экспрессии генов в моделях тканей мозга.
- Практическая ценность: использует метод изоляции РНК с помощью магнитных частиц, совместимый с высокопроизводительными рабочими процессами, что способствует стандартизации в ходе кампаний по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает профилирование транскриптома в моделях на мышах, имеющих значение для изучения заболеваний, что соответствует усилиям по поиску трансляционных биомаркеров при нейропсихиатрических и нейродегенеративных расстройствах.
- Практическая ценность: Обеспечивает целостность РНК за счет использования протоколов, исключающих воздействие РНаз, что повышает воспроизводимость в лонгитюдных доклинических исследованиях и сопоставимость данных между различными лабораториями.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска — от проверки гипотез о мишенях до идентификации перспективных соединений, где точное профилирование РНК в определенных областях мозга позволяет обосновать выбор и приоритизацию мишеней перед доклинической валидацией.
- Открытия в биологии: способствует уточнению путей и снижению биологических рисков, позволяя проводить транскриптомное сравнение различных областей мозга, связанных со специфическими нейронными цепями.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированного РНК-исходного материала, подходящего для количественного скрининга экспрессии генов, что повышает воспроизводимость анализов взаимодействия с мишенью.
- Аналитика: позволяет получать высококачественную РНК для спектрофотометрического и флуорометрического количественного определения, что обеспечивает точную нормализацию исходного материала для секвенирования и приложений на основе ПЦР.
- Трансляционные исследования: связывает профилирование экспрессии на этапе открытия с доклиническими исследованиями, предоставляя релевантные заболеванию транскриптомные данные из определенных областей мозга.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для сбора тканей и выделения РНК, применимую в многочисленных нейробиологических проектах и для различных классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности благодаря точным данным об экспрессии в конкретных областях мозга.
- Практическая ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря рабочим процессам без использования РНказы и минимальному количеству ручных операций (8–10 минут на образец).
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя получать несколько региональных образцов от одного животного, что снижает затраты, связанные с низкопродуктивными методами, требующими амплификации.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней с учетом рисков, предоставляя надежные данные о транскриптоме для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) препаратов для ЦНС.
Рекомендации по реализации
- Требуются экспертные знания в области нейроанатомии и владение методикой работы в условиях отсутствия РНказ для сохранения целостности образцов при диссекции и экстракции РНК.
- Необходим доступ к тканевому чопперу с микрометрическим управлением, просекателям для ткани заданного диаметра и наборам для изоляции РНК на основе магнитных частиц.
- Требуется применение стандартизированных протоколов работы в безРНказной среде всеми группами исследователей для обеспечения согласованности качества РНК между различными исследованиями.
- Адаптация метода для других отделов мозга или других видов может потребовать оптимизации диаметра просекателя и параметров секционирования.
- Практическое ограничение: ручной пробоотбор ткани может ограничить возможность применения метода в сверхвысокопроизводительных исследованиях по сравнению с автоматизированными системами лазерного захвата, хотя и обеспечивает более высокий выход РНК.
