Профилирование напряжения закрытого калия Выражение мРНК канала в Nigral Нейроны использованием Одноклеточный-ПЦР методов

Общая цель данной процедуры заключается в обнаружении матричных РНК в отдельных нейронах. Это достигается путем патч-клампирования и регистрации отдельных нейронов с последующим полным аспирированием цитоплазмы из каждого зарегистрированного нейрона для выделения мРНК и цитоплазмы. Затем синтезируется кДНК, которая амплифицируется с помощью ПЦР.

В конечном итоге специфические мРНК рецепторов, ионных каналов и ферментов могут быть обнаружены с помощью стандартной системы гель-визуализации. Меня зовут [Имя], я работаю в Центре медицинских наук Университета Теннесси. Как правило, люди, которые впервые используют этот метод, сталкиваются с трудностями, так как количество мРНК в одном нейроне крайне мало, и они легко теряются.

Начните выполнение данного протокола с нарезания корональных срезов мозга толщиной 300 микрометр с помощью вибратома таким образом, чтобы в срезы попадала средняя ростральная часть черной субстанции. Мозг можно выделить из крыс линии Sprague-Dawley в возрасте от 15 до 40 дней. Процедуру нарезания срезов проводят на льду в растворе для нарезания с высоким содержанием сахарозы, насыщенном смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа при pH 7.4; затем инкубируют срезы в искусственной спинномозговой жидкости, насыщенной смесью 5% углекислого газа и 95% кислорода.

Поддерживайте температуру на уровне 34 °C и выдержите срезы в течение 45 минут. Затем храните срезы мозга при комнатной температуре до начала регистрации. Начните с переноса одного среза мозга в камеру для пэч-кламп регистрации.

Проводите непрерывную перфузию оксигенированной искусственной спинномозговой жидкостью при температуре 32 °C. Заполните патч-пипетки внутриклеточным раствором, приготовленным на воде, очищенной от ДНК и РНК, и подвергнутым автоклавированию. Опустите заполненную пипетку в ванну.

Убедитесь, что сопротивление составляет от двух до трех МОм. Сначала найдите черную субстанцию, ориентируясь по ее характерному анатомическому расположению. Затем, используя оптику Namar и объектив 60x, выберите крупные клетки в SNC и SNR для регистрации.

Это, безусловно, могут быть дофаминергические или ГАМК-ергические нейроны. Используйте стандартную конфигурацию «whole-cell» с гигаомным сопротивлением мембраны для проведения записей в режимах фиксации тока и фиксации потенциала. Эти записи обычно следует проводить менее чем за пять минут, чтобы минимизировать деградацию мРНК.

Примерно за одну минуту можно получить электрофизиологические профили интересующих нейронов, регистрируя только свойства их мембраны и спайковую активность. После получения данных от нужного нейрона осторожно аспирируйте цитоплазму с помощью присасывания ртом. Плотное прилегание пипетки не должно быть нарушено, иначе.

В патч-пипетку могут попасть внеклеточные остатки, включая мРНК, что приведет к загрязнению содержимого клетки. Вытесните содержимое клетки в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл, отломив кончик пипетки и приложив легкое положительное давление. По завершении немедленно поместите пробирку в морозильник при температуре -20 °C, чтобы исключить загрязнение внеклеточными остатками, которые могут содержать мРНК.

Подготовьте отрицательный контроль, собрав содержимое патч-пипетки, опущенной в ткань, без проведения аспирации. После сбора содержимого от 10–20 нейронов немедленно приступайте к реакции обратной транскрипции. Чтобы минимизировать деградацию мРНК, начните с переваривания любой контаминирующей геномной ДНК с помощью DNase I в течение пяти минут при 25 °C.

Этот этап имеет решающее значение для снижения вероятности появления ложноположительных результатов, поэтому его нельзя пропускать. Затем инактивируйте ДНК, добавив 1.2 µL 25 mM EDTA, и инкубируйте образцы при 70 °C в течение пяти минут. Теперь используйте имеющийся в продаже набор для синтеза кДНК, чтобы подтвердить полное удаление геномной ДНК.

Проведите контрольную реакцию для каждого образца без обратной транскриптазы, оставив все остальные компоненты реакции без изменений. Храните полученные продукты при температуре -20 °C до момента проведения ПЦР.

Праймеры подбирают согласно последовательностям в Gen bank; по возможности используют праймеры, перекрывающие границы интронов, чтобы помочь в обнаружении контаминации геномной ДНК. Для проверки эффективности пар праймеров на первом этапе их тестируют на кДНК из всего мозга. ПЦР-амплификацию 5 µL из 30 µL кДНК проводят в течение 35 циклов, используя стандартный протокол термоциклирования.

Для второго этапа проведите ПЦР-амплификацию 1 µL продукта ПЦР первого этапа с использованием тех же праймеров, применив слегка измененный профиль циклов. Затем разделяют полученные продукты на 2,5% AGROS-геле и визуализируют их с помощью бромида этаidium или GelGreen. В УФ-свете вырежьте положительные полосы ДНК и проведите их секвенирование с использованием коммерчески доступного набора для выделения ДНК.

Было проведено сравнение электрофизиологических характеристик нейронов компактной и ретикулярной частей черной субстанции. ГАМК-ергические нейроны SNR демонстрировали более высокую частоту спонтанных спайков, составляющую около 10 hertz. При инъекции гиперполяризующего тока базовая длительность спайков составляла около одной миллисекунды.

ГАМК-ергические нейроны SNR демонстрировали слабый SAG-ответ, что указывает на слабо активированный ток. Напротив, нигро-дофаминергические нейроны проявляли спонтанные спайки низкой частоты с базовой длительностью около трех миллисекунд. Дофаминергические нейроны также показали выраженный SAG в ответ на гиперполяризацию, что свидетельствует о сильной экспрессии тока IH в ГАМК-ергических нейронах SNR, но не в дофаминергических нейронах.

Метод одноклеточной ОТ-ПЦР выявил мРНК глутаматдекарбоксилазы 1, ключевого фермента синтеза ГАМК. Напротив, одноклеточная ОТ-ПЦР выявила мРНК тирозингидроксилазы, ключевого фермента синтеза дофамина, в идентифицированных дофаминергических нейронах SNC и SNR, но не в ГАМКергических нейронах.

Далее была использована ОТ-ПЦР единичных клеток для профилирования экспрессии субъединиц вольтаж-зависимых каналов KV3, которые определяют свойства вольтаж-зависимых калиевых каналов. В примере с SNR gaba мРНК KV 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4 нейронов были обнаружены только в примере нейрона S-N-R-D-A. KV 3.2, 3.3 и 3.4 были обнаружены в объединенных данных.

KV 3.1 обнаруживался в ГАМК-ергических нейронах SNR чаще, чем в дофаминергических нейронах черной субстанции, что указывает на более высокий уровень экспрессии KV 3.1 в быстро инактивирующихся ГАМК-нейронах SNR. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования перчаток и поддержания чистоты инструментов после их использования. Этот метод открыл исследователям в области нейронаук путь к изучению экспрессии и функций рецепторов и ионных каналов в нервной системе.