Изоляция и характеристика Hoechst ^Низкий CD45 ^{Отрицательный} Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

В данном видео демонстрируется протокол выделения хозяйских мезенхимальных стволовых клеток легких с низким уровнем экспрессии CD 45. Тканевые резидентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются важными регуляторами восстановления или регенерации тканей, фиброза, воспаления и ангиогенеза. Сначала из эвтаназированной мыши извлекают легкие.

Легочная ткань подвергается дигестии для получения суспензии единичных клеток. Клетки окрашивают красителем hoax и антителами к CD 45, после чего проводят сортировку методом проточной цитометрии для выделения легочных МСК с низким содержанием CD 45 или CD 45-отрицательных клеток хозяина. Затем легочные МСК экспансируют в культуре и проводят анализ колониеобразующей способности для оценки дифференцировочного потенциала МСК.

Затем можно провести дальнейшие исследования для изучения роли МСК при гомеостазе тканей и заболеваниях. Метод, представленный здесь, может быть использован для выделения мезенхимальных стволовых клеток легких мыши или человека и может быть применен при изучении таких заболеваний легких, как легочный фиброз, легочная гипертензия и ХОБЛ. Как правило, лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за многообразия существующих способов подготовки тканей, а также особенностей настройки проточного цитометра, подбора соответствующих контролей и проведения анализа.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку крайне сложно описать словами правильную технику измельчения и переваривания ткани легкого для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток. Кроме того, настройка прибора для проточной цитометрии и проведение анализа лучше всего передаются через демонстрацию. Начните выполнение данного протокола с извлечения легких из принесенной в жертву взрослой мыши, которые будут использованы для получения мезенхимальных стволовых клеток.

С помощью небольших острых ножниц сделайте латеральные разрезы грудной клетки мыши с обеих сторон. Вскройте грудную полость, затем удалите диафрагму. Введите шприц объемом 10 milliliter с иглой 20.5 gauge в правый желудочек сердца и плавно нажмите на поршень, чтобы перфузировать его 3–5 milliliters PBS, вымывая кровь из легких.

Затем с помощью ножниц отсеките трахею и главный бронх и удалите их. После этого с помощью пинцета извлеките небольшие белые доли легких и перенесите их в чашку Петри, наполненную сбалансированным солевым раствором Хэнкса или HBSS.

Затем удалите сердце и разделите доли легких. Повторите эту процедуру для всех мышей, участвующих в исследовании. Перенесите доли легких на крышку чашки.

Увлажните ткань небольшим количеством HBSS, чтобы предотвратить её высыхание. Затем с помощью одноразового скальпеля измельчите доли легкого для получения костного мозга, который будет использоваться в качестве поддерживающего контроля для проточной цитометрии. Используя острые ножницы, сделайте разрезы в области голеностопного сустава и в верхней части бедренной кости.

Поместите конечность в новую чашку Петри. Затем отсеките коленный сустав, оставив линейный фрагмент бедренной кости и второй фрагмент, содержащий большеберцовую и малоберцовую кости. С помощью пинцета удалите мышцы, чтобы обнажить большеберцовую, малоберцовую и бедренную кости.

Теперь возьмите шприц объемом 5 мл с иглой калибра 26,5 G и введите иглу в отверстие костного мозга. Зафиксируйте большеберцовую кость за один конец так, чтобы другой конец был направлен в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную 15 мл HBSS, и нажмите на plunger, чтобы выпустить HBSS и промыть костный мозг в пробирку. Повторите эту процедуру с малоберцовой и бедренной костями.

Окрасьте костный мозг красителем host 3 3 3 4 2 в конечной концентрации 5 µg/mL в дополненной среде DMEM с высоким содержанием глюкозы. Затем из изолированной ткани легкого будет приготовлена суспензия одиночных клеток. Поместите каждое легкое в пробирку, содержащую предварительно нагретый 0.2% Worthington.

Приготовьте коллагеназу II типа в стерильном растворе HBSS, затем поместите пробирку в водяную баню при 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут. После инкубации с помощью пипетки на 10 мл тритурируйте образец до тех пор, пока дигестат не начнет легко проходить через пипетку. Повторите процедуру примерно 10 раз, после чего инкубируйте еще 15 минут при 37 °C для полного переваривания ткани.

После завершения дигестии разбавьте клеточную суспензию раствором HBSS и с помощью пятимиллилитровой пипетки повторно диспергируйте любые оставшиеся фрагменты ткани. Затем, чтобы удалить непереваренные фрагменты ткани, пропустите суспензию через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавляйте суспензию небольшими порциями, чтобы образец успевал проходить через клеточный фильтр.

Если непереваренные фрагменты ткани полностью блокируют поток клеточной суспензии, процедите ее через новый фильтр для клеток в новую пробирку. Осадите клеточную суспензию центрифугированием в течение 10 минут при 450 RCF.

После центрифугирования слейте супернатант и осторожно ресуспендируйте осадок клеток в буфере для лизиса эритроцитов при комнатной температуре; инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте равный объем HBSS для инактивации лизирующего буфера.

Перелейте суспензию клеток через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм для удаления клеточного дебриса и агрегатов, собирая фильтрат в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Затем с помощью гемоцитометра определите количество клеток в образцах легкого и костного мозга. Запишите концентрацию и общий объем суспензии клеток.

Затем осадите суспензию единичных клеток легкого путем центрифугирования при 450 RCF в течение 10 минут. Для поддержания жизнеспособности клеток ресуспендируйте клетки легкого и костного мозга одновременно в предварительно прогретом supplemented high glucose DMEM в концентрации 10⁶ клеток на мл.

Для окрашивания ДНК добавьте краситель HOAXED 3 3 3 4 2 до конечной концентрации 5 µg/L. Затем перемешайте клетки путем осторожного переворачивания пробирки и инкубируйте на водяной бане при 37 °C ровно 90 минут. После этого центрифугируйте в течение 10 минут при 450 ×g, при этом после центрифугирования поддерживайте температуру 4 °C.

Приступите к окрашиванию тканей легкого и костного мозга антителами к CD 45 и пропидиумйодидом для последующего анализа методом проточной цитометрии. После окрашивания клеток храните пробирки на льду в защищенном от света месте до проведения анализа. Подготовьтесь к проточной цитометрии, убедившись, что лазеры прибора юстированы, а система настроена на сортировку клеток.

Используемый прибор должен быть оснащен синим лазером с длиной волны 488 нм, красным лазером с длиной волны 635 нм и УФ-лазером с длиной волны от 350 до 355 нм, а также двумя детекторами на пути УФ-лазера с синими фильтрами 45/65 и красными фильтрами 675/50. Кроме того, УФ-красный детектор должен обладать высокой чувствительностью к красному сигналу, а прибор должен быть оснащен охладителем (чиллером) для поддержания температуры образца на уровне 10 °C. В программном обеспечении прибора настройте гистограммы для отображения линейного прямого светорассеяния (FSC) относительно бокового светорассеяния (SSC), а также график дискриминации дуплетов, соответствующий данной модели прибора.

Гистограмма PI с логарифмическим сигналом, график распределения красных и синих популяций с линейными сигналами и гистограмма CD 45 A PC с логарифмическим сигналом. Как только прибор будет готов, поместите окрашенный образец костного мозга в загрузочный порт прибора. Этот образец используется в качестве контроля окрашивания и настройки прибора.

Начните сбор событий и настройте линейные сигналы прямого и внутреннего светорассеяния. Для четкой визуализации популяции клеток они должны располагаться примерно в нижней центральной части графика, где по оси x отложено прямое светорассеяние. Поскольку ядерный краситель PI проникает через мембраны только поврежденных клеток, он не будет проникать в живые клетки.

Очертите область гейта для мертвых клеток, положительных по PI, на гистограмме PI. В программном обеспечении прибора задайте окрашивание мертвых клеток в этом гейте в красный цвет.

Для идентификации популяции клеток хозяина в фазе G0/G1 удобно использовать окрашенные мертвые клетки в качестве ориентира. Краситель PI также возбуждается УФ-лазером, и большинство мертвых клеток должны находиться за пределами шкалы. В правой части графика флуоресценции хозяина (красный против синего) популяция костного мозга в фазе G0/G1 должна быть видна как плотный кластер событий.

Отрегулируйте напряжение детекторов так, чтобы кластер G0 G1 располагался в верхней правой части графика, сместившись от центра. Часть S-фазы и вся фаза G2 клеточного цикла могут оказаться за пределами шкалы. В верхней правой части графика зависимости красного сигнала от синего будут видны клетки с низкой активностью по выведению красителя (side population), которые тянутся от левой стороны кластера G0 G1 вниз к нижнему левому углу графика.

Теперь выделите гейтом кластер клеток на графике FSC по отношению к SSC. Постройте распределение популяции синглетов, определенной на графике дублетов, и живых клеток на гистограмме PI. Затем настройте график, чтобы отображались только эти выделенные популяции.

После проведения гейтирования на основном графике выделите область вокруг боковой популяции (side population). Назначьте эту область в качестве гейта для гистограммы CD 45 A PC вместе с гейтами синглетов по боковому рассеянию и живых клеток. После завершения настройки системы извлеките образец из порта загрузки и поместите в него образец легкого.

Настройки прибора для данного образца повторно корректировать не потребуется. Начните сбор событий на графике «красный против синего» (red versus blue hoax plot). Кластер G zero G one для образца легкого обычно выглядит более вытянутым вдоль оси x и напоминает символ тильды на клавиатуре.

Порог гейта для боковой популяции (side population) должен быть установлен примерно в том же положении, что и для образца костного мозга. Для обеспечения четкого разрешения боковой популяции могут потребоваться небольшие корректировки порога вверх или вниз. Чтобы поддерживать низкий перепад давления во время сортировки, следите за тем, чтобы клапан подачи образца не был открыт слишком сильно.

Для выделения МСК поместите 96-луночный планшет для сбора в камеру сортировки и настройте гейты сортировки на гистограмме CD 45 A PC, чтобы разделить положительную и отрицательную популяции. В завершение соберите клетки либо в виде смешанной популяции в пробирку, либо в виде одиночных клеток в 96-луночный планшет для выделения клонов. После сбора МСК легких методом сортинга клеток их высевают в чашки диаметром 30 мм с использованием среды A MEM, дополненной 20% FBS. Сначала отсортированные клетки выглядят маленькими, круглыми и яркими; этот процесс занимает примерно две-три недели.

Становятся заметны колонии с мезенхимальным фенотипом, а пролиферация становится более выраженной для каждой клеточной подготовки. Оцените способность МСК легких дифференцироваться в традиционные мезенхимальные линии остеобластов, адипоцитов и хондроцитов, а также экспрессию общепринятых мезенхимальных маркеров на их поверхности. Проведите цитогенетический анализ с окрашиванием полосами для подтверждения отсутствия грубых хромосомных аномалий.

После изоляции методом проточной цитометрии и получения клонов единичных клеток проводится анализ колониеобразующей способности для характеристики МСК и их дифференцировочного потенциала. Начните с клеток, разведенных до концентрации 3 × 10⁴ клеток на миллилитр. Используя неполную среду для культивирования в чашках диаметром 100 мм, выполните серийные разведения: 2 × 10⁴, 6 × 10⁴, 3 × 10⁴, 1,5 × 10⁴ и 0,75 × 10⁴ клеток на чашку в 10 мл среды в трех повторностях.

Затем, после 10 дней культивирования, поместите планшеты в инкубатор, слейте среду и промойте клетки PBS. Затем зафиксируйте их, добавив 100% метанол на пять минут при комнатной температуре. Через пять минут слейте метанол.

Затем для обнаружения образования колоний добавьте 0,4% (вес/объем) gza, разведенного деионизированной водой в пропорции 1:20, и инкубируйте в течение 10–15 минут. Затем слейте краситель и промойте образцы деионизированной водой. Дайте образцам высохнуть на воздухе и подсчитайте количество колоний, содержащих более 25 клеток, используя инвертированный микроскоп или систему визуализации.

Колонии крупные, состоят из нескольких сотен клеток, как показано здесь, и обладают мезенхимальным фенотипом. МСК были выделены, как показано в этом видео, и высеяны в 96-луночные планшеты для симуляции роста. Затем к МСК легких были добавлены остановленные в развитии антигенпрезентирующие клетки, меченные CFSE.

Пролиферация изолированных MSC затем измерялась как снижение средней интенсивности флуоресценции CFSE по сравнению с фоном, который представлял собой только меченые CFSE Т-клетки, как показано на данном рисунке; в отсутствие легочных SC и при наличии антигенпрезентирующих клеток (APC) CD40-положительные эффекторные Т-клетки демонстрируют снижение интенсивности CFSE, что указывает на пролиферацию (обведено красным). Интенсивность флуоресценции CFSE мембраны Т-клетки снижается экспоненциально при каждом делении клетки, т. е. в два раза при каждом делении. В присутствии легочных MSC APC и CD40-положительных эффекторных Т-клеток значимых изменений интенсивности CFSE не наблюдается, что указывает на отсутствие пролиферации. Разработка данного метода открыла исследователям в области биологии стволовых клеток легких путь к изучению роли мезенхимальных стволовых клеток при таких заболеваниях легких, как легочная артериальная гипертензия и легочный фиброз.

После освоения выполнение данной техники в соответствии с этой процедурой занимает примерно пять часов. Для получения дополнительных ответов могут быть проведены другие методы, такие как анализы на дифференцировку, чтобы определить, демонстрируют ли предполагаемые мезенхимальные стволовые клетки легких соответствующую мультилинейную дифференцировку с потенциалом образования костной, жировой и хрящевой тканей.