Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки

Общая цель данного эксперимента — флуоресцентно метить вирус денге для микроскопических исследований. Подготовьте необходимые буферы, очистите вирус денге с помощью сахарозной подушки, восстановите краситель Alexa Fluor и вирус денге в буфере для мечения. Проведите мечение вируса денге с использованием Alexa Fluor в концентрации 100 µM.

Инкубируйте в течение одного часа и остановите реакцию мечения с помощью соответствующего реагента. Очистите меченый вирус денге с помощью колонки для эксклюзионной хроматографии. Повторно определите титр меченого вируса с помощью метода бляшек и оцените степень мечения с помощью метода иммунофлуоресценции.

Здравствуйте, я Сэм Джанг из Национальных лабораторий DSO, работаю в лаборатории доктора Ви в программе по новым инфекционным заболеваниям после окончания медицинской школы NUS. Сегодня я покажу вам, как флуоресцентно метить вирус Денки с помощью антиреактивного красителя Alexa Flu для проведения имиджинговых исследований. Красители Alexa Flu обладают превосходной стабильностью и менее чувствительны к pH, чем распространенные красители, такие как флуоресцеин и родамин, что делает их идеальными для изучения клеточного захвата и эндосомального транспорта вируса.

Маркировка вируса денге красителем Alexa Fluor поможет в понимании патогенеза денге. Итак, приступим. Перед проведением реакции маркировки подготовьте свежий буфер для маркировки и стоп-реагент согласно письменному протоколу, а также очистите вирус денге методом сахарозной подушки; добавьте соответствующий объем очищенного вируса денге в буфер для маркировки в микроцентрифужной пробирке, чтобы достичь концентрации 300 миллионов инфекционных единиц на миллилитр.

Эту процедуру можно пропорционально масштабировать для серийного мечения вируса. Непосредственно перед реакцией мечения восстановите лиофилизированный краситель Alexa до концентрации 1 мМ в буфере для мечения.

Начиная с этого этапа, минимизируйте воздействие света. В демонстрационных целях краситель Alexa floor будет оставлен незащищенным от света. Добавьте 800 µL 1 mM красителя Alexa flow к разведенному вирусу денге, осторожно перемешивая наконечником микропипетки.

Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте, аккуратно перемешивая путем переворачивания каждые 15 минут. Через один час кратковременно центрифугируйте пробирки. Перенесите 800 µL из данной области, осторожно перемешивая микропипеткой, и инкубируйте еще один час при комнатной температуре в защищенном от света месте, аккуратно перемешивая путем переворачивания каждые 15 минут.

Тем временем уравновесьте колонку для очистки 25 миллилитрами буфера HNE. После одного часа инкубации нанесите меченный вирус на колонку и начните сбор проскока. Заполните колонку буфером HNE.

После того как весь меченый вирус поступит в матрицу, слейте первые 2,5 milliliters фильтрата и соберите следующие два milliliters фракции меченого вируса. Заморозьте и храните очищенный меченый вирус при температуре Minus 80 degrees Celsius. Определите титр меченого вируса с помощью метода бляшек.

В типичном эксперименте должно наблюдаться снижение титра вируса менее чем в десять раз. После мечения следует провести анализ иммунофлуоресценции для оценки степени мечения. Для этого подсчитайте количество вирусных клеток с помощью гемоцитометра и добавьте соответствующий объем клеток в ростовую среду, чтобы достичь плотности 50 000 клеток на миллилитр.

Добавьте по 1 мл вирусных клеток в каждую лунку четырехлуночного планшета, содержащего стерильное стеклянное покровное стекло. Инкубируйте клетки overnight при 37 °C в атмосфере с 5% CO2. Извлеките планшет из инкубатора и аспирируйте супернатант из лунок, затем добавьте в лунки меченый вирус с MOI примерно 1 в объеме 100 µL на 10 минут при 37 °C.

Удалите инокулят и промойте клетки 0,5 мл буфера PBS на лунку. Повторите эту процедуру еще два раза. Зафиксируйте клетки, добавив 200 мкл 3% параформальдегида в каждую лунку, и выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут.

Трижды промойте клетки 0,5 миллилитрами PBS-буфера на лунку. Проведите фиксацию клеток с использованием фиксирующего раствора при комнатной температуре в течение 30 минут. С помощью тонкого пинцета снимите покровное стекло с лунки.

Удалите излишки жидкости, промакнув край покровного стекла фильтровальной бумагой. Аккуратно сдвиньте стекло по бумажному полотенцу. Установите сторону покровного стекла, обращенную к клеткам, вниз.

Нанесите 25 µL антител к белку e вируса денге на покровное стекло. Инкубируйте в течение одного часа в увлажненной камере при комнатной температуре в защищенном от света месте. Затем перенесите покровное стекло в шестилуночный планшет и добавьте по 2 мл промывочного буфера в каждую лунку.

Оспирируйте супернатант. Повторите эти этапы промывки еще два раза после последнего промывания. Снимите покровное стекло из лунки с помощью тонкого пинцета.

Удалите излишки жидкости, приложив край покровного стекла к бумажной салфетке. Аккуратно прижмите край стекла, чтобы оно плотно прилегало к образцу.

Нанесите 25 µL вторичного антитела Alexa Fluor 488 anti-mouse на предметное стекло. Инкубируйте в течение 45 минут в увлажненной камере при комнатной температуре в защищенном от света месте. По завершении инкубации перенесите покровное стекло в 6-луночный планшет и промойте клетки трижды, используя по 2 мл промывочного буфера для каждой промывки. После последней промывки извлеките покровное стекло из лунки и один раз ополосните его в деионизированной воде.

Удалите излишки жидкости, прижав образец к бумажной салфетке. Закрепите покровное стекло на предметном стекле, используя 8 µL мягкого закрепляющего раствора. Оставьте образец для полного высыхания раствора на ночь при температуре 4 °C.

Теперь образец готов к визуализации с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. Нанесите небольшую каплю иммерсионного масла на поверхность покровного стекла и закрепите предметное стекло на предметном столике микроскопа.

Отрегулируйте положение предметного столика до тех пор, пока объектив микроскопа не коснется иммерсионного масла. Для получения четкого изображения выключите внешнее освещение с помощью программного обеспечения Zeiss Zen. Перейдите на вкладку «Окуляр» для непосредственного наблюдения за образцом через окуляр микроскопа.

Найдите поле с клетками и настройте фокус. Теперь переключитесь в режим сбора данных. Чтобы минимизировать перекрестные помехи между флуорофорами, выберите отдельные треки для Alexa Fluor 488 и DAPI.

Настройте красители и параметры сбора данных для последовательного возбуждения и детектирования. Отрегулируйте усиление и смещение мощности лазера, чтобы изображение не было переэкспонированным или недоэкспонированным. Снимите изображение и проанализируйте интересующую область с помощью функции колокализации.

Коэффициент перекрытия может быть использован для оценки степени мечения вируса денге красителем Alexa Flo. Был проведен простой иммунофлуоресцентный анализ клеток, зараженных вирусом, и степень мечения была оценена по колокализации меченого вируса с антителами к белку E; коэффициент перекрытия при окрашивании антителами составил от 0,65 до 0,8, что указывает на мечение примерно 65–80% вариантов красителем Alexa Flo. Для успешного проведения процедуры мечения важно подготовить буфер для мечения, использовать свежеприготовленные реагенты и восстановить краситель Alexa Flo непосредственно перед началом мечения.

Концентрацию красителя можно дополнительно оптимизировать в соответствии с вашими потребностями. Этот метод горизонтального мечения вируса денге может быть потенциально адаптирован для мечения других вирусов. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в проведении вашего эксперимента по маркировке.