Аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников-Посев Технология и Биосовместимость Тестирование Для сердечно-сосудистой устройства в Большой Модель животных

Общая цель данного эксперимента заключается в заселении сосудистых имплантатов аутологичными эндотелиальными клетками-предшественниками, полученными из крови, с последующим наблюдением за влиянием данной процедуры на тромбоз в модели на крупных животных. Это достигается путем забора образца периферической крови свиней для выделения свиных эндотелиальных клеток-предшественников позднего выросшего слоя. Далее используется имплантируемое устройство.

В нашем исследовании по проверке концепции титановая трубка заполняется аутологичными ПК. Затем устройство имплантируют в нижнюю полою вену свиньи. Результаты показывают защиту от тромбоза, основываясь на проходимости титановой трубки, заполненной ЭПК, по сравнению с контрольной группой и окклюзированной незащищенной металлической трубкой.

Хирургический факультет Университета Дьюка стремится к поддержке прорывных и инновационных исследований. Следующая презентация является примером того, как мы взаимодействуем между кафедрами и дисциплинами для развития медицины. Доктор EK руководит исследовательским проектом по разработке технологии «посадки» клеток, которая позволит предотвратить тромбоз путем выстилания поверхностей сосудистых устройств, контактирующих с кровью, собственными прогениторными клетками пациента.

Поскольку данные клетки были получены от тех же пациентов, которые получат имплантат, мы избегаем отторжения иммунной системой. Наш успех и описанные здесь методы являются результатом усилий большой команды. Хирургическую имплантацию продемонстрируют Шон Гейдж из отделения сосудистой хирургии, Уитни Лейн, студент медицинского факультета Университета Дьюка, и я.

Теперь я хотел бы представить Александра Янссена, аспиранта кафедры биомедицинской инженерии, который подробно расскажет нам о процессе посева клеток. Я продемонстрирую, как осуществлять посев эндотелиальных прогениторных клеток, полученных из крови, в титановые трубки непосредственно перед имплантацией в модель свиньи. Данный метод служит доказательством концепции, и те же основные принципы могут быть применены ко многим другим имплантируемым устройствам, таким как нитиноловые стенты и механические устройства вспомогательного кровообращения. EPCs выделяют путем посева фракции мононуклеарных клеток крови свиньи, и обычно они появляются примерно через семь дней.

Их можно распознать по типичной «булыжной» морфологии. Нарастите количество EPC до 9 миллионов клеток в культуре. Дважды промойте подготовленные EPC безсывороточной средой, стараясь ограничить их воздействие света во время и после маркировки.

Затем добавьте к клеткам флуоресцентную метку PKH 26 и зафиксируйте объем внесенного раствора. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение четырех минут. Через одну минуту остановите реакцию мечения, добавив к раствору красителя равный объем свиной сыворотки.

Разбавьте объединенные растворы в соотношении один к одному полной ростовой средой. Затем аспирируйте жидкость и трижды промойте клетки полной ростовой средой, после чего проведите две промывки DPBS без хлорида кальция или магния. Затем покройте клетки трипсином, отметив использованный объем, и инкубируйте их при 37 °C.

После трех минут инкубации с помощью микроскопии проверьте, открепились ли клетки; если да, добавьте раствор для нейтрализации трипсина в объеме, в два раза превышающем объем добавленного трипсина. Объедините клеточные суспензии в одну пробирку и измерьте плотность клеток с помощью гемоцитометра. Наконец, осадите клеточную суспензию центрифугированием и ресуспендируйте клетки в объеме не менее 4,5 milliliters безсывороточной среды.

После подготовки свиньи к операции сделайте разрез по срединной линии с помощью скальпеля с лезвием № 15, начиная от второго комплекса молочных желез. Осторожно рассекайте ткани электрокоагулятором в направлении к предпоследнему комплексу желез. Выполните диссекцию до уровня фасции брюшной стенки.

Приподнимите брюшину зажимом типа «москит» и осторожно сделайте разрез ножницами Метценбаума, выведите мочевой пузырь наружу и наложите круговой шов нитью Vicryl 3-0 на стенку пузыря. Сделайте точечный разрез в центре шва и введите через него катетер Фолея 16 Fr. Затем введите внутривенные растворы, чтобы поддерживать диурез на уровне не менее 1 мл/кг/час в течение операции.

Затем выведите наружу расшиленный отдел тонкой кишки и установите два хирургических ретрактора Бура, чтобы открыть заднюю часть брюшной полости и идентифицировать нижнюю полостую вену (НПВ) с помощью острого и тупого расслоения. Осторожно освободите НПВ от окружающих тканей. Затем проведите скелетизацию сосуда от правой почечной артерии проксимальнее бифуркации НПВ до дистального конца.

Соблюдайте крайнюю осторожность при диссекции нижней полой вены (НПВ), так как даже очень небольшой дефект в НПВ может привести к быстрому кровотечению и обескровливанию животного при лигировании. Особое внимание уделите диссекции и лигированию всех боковых ветвей сегмента НПВ, в частности двух крупных задних поясничных вен, расположенных непосредственно проксимальнее бифуркации НПВ. Со стороны спины часто обнаруживается крупная поясничная вена.

Аккуратно выделите эту вену и зафиксируйте её с помощью сосудистых петель. Теперь, параллельно с ходом операции, приступайте к заселению имплантата EPCs перед началом данной процедуры. Титановые трубчатые скаффолды для размещения тканей должны быть полностью собраны и готовы к использованию в стерильной зоне.

Откройте газостерилизованную сборку из титановой трубки в шприце объемом 5 cc. Затем извлеките поршень из шприца объемом 5 cc, но не утилизируйте его. Плотно закройте шприц колпачком. С помощью пипетки заполните шприц суспензией EPC.

Затем установите поршень на место. Снимите колпачок и вставьте конец шприца с конусом в открытый силиконовый шланг сборки до плотного прилегания. Не продвигая шприц далее, удалите пузырьки воздуха, медленно подавая раствор для клеток, пока он не достигнет верхней части головки.

Затем закройте сборку колпачком Люра и плотно зафиксируйте его лентой, работая в стерильных перчатках. Поместите всю сборку в специальный держатель для шприца и поместите его в инкубатор при 37 °C. Используйте измерительный прибор, чтобы убедиться, что посадочные камеры расположены горизонтально, и оставьте сборку инкубироваться при медленном вращении.

Продолжите операцию сразу после лигирования нижней полой вены (НПВ), введя 100 единиц гепарина на килограмм массы тела свиньи. Затем немедленно зажмите НПВ зажимом под углом 45 градусов дистально относительно НПВ и поясной вены, а затем проксимально. Далее, используя скальпель с лезвием номер 11 и ножницы для вскрытия, выполните продольную венотомию длиной четыре сантиметра между проксимальным и дистальным зажимами.

Удалите всю кровь из нижней полой вены (НПВ) и промойте ее внутренний просвет стерильным DPBS. Теперь введите в НПВ имплантат с закрепленными EPC или контрольный образец из чистого металла, чтобы предотвратить высыхание клеток и удалить воздух. Заполните НПВ раствором DPBS с хлоридом кальция и хлоридом магния.

Затем зашейте венотомную область непрерывным швом из пролена 4-0 и снимите один проксимальный зажим, чтобы удалить воздух из НПП посредством небольшого обратного кровотечения. После прекращения кровотечения снимите дистальный зажим, чтобы зафиксировать имплантат на месте. Наложите удерживающий шов на трубку PVC, проходящую через стенку вены.

Зашейте фасцию швом OPDS, используя иглу CT. Зашейте подкожное пространство непрерывным швом нитью 2-0 Vicryl. Затем закройте кожу с помощью хирургического степлера.

Подкожно введите до 20 миллилитров 0,25% Marcaine вдоль места разреза, затем накройте рану марлей и tegaderm для облегчения боли. При необходимости подкожно введите flu Nixon и оксиморонфон. Прекратите анестезию и, когда свинья проснется, верните ее в клетку на следующие семь дней.

Вводите atri каждые 24 часа в качестве антибиотикопрофилактики и убедитесь, что пластырь с фентанилом, наложенный перед операцией, остается приклеенным в течение трех дней. По истечении трех дней имплантированные в сидячем положении титановые трубки были извлечены, и их внутренние поверхности были изучены. При длине волны возбуждения 550 нанометров в другой трубке был обнаружен сплошной слой флуоресцентно меченых клеток.

Срезы клеток были дополнительно окрашены с использованием маркера адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам для визуализации границ клеток. В данной процедуре может быть использован широкий спектр красителей. Напротив, имплантат в виде незащищенной титановой трубки полностью окклюзирует в условиях протромботической среды с низким сдвигом в нижней полой вене.

Как показано на изображениях A и C, титановая трубка с закрепленными клетками представлена на изображении B и осталась без тромбов после нашей процедуры изоляции с использованием периферической крови. EPC появляются в культуре в среднем через семь дней. При выполнении хирургической операции крайне важно осторожно и аккуратно скелетизировать НПВ, поскольку даже самый небольшой разрыв НПВ или его боковых ветвей может привести к обескровливанию свиньи. После этой процедуры другие материалы, контактирующие с кровью, могут быстро подвергнуться эндотелизации для предотвращения тромбоза.

Эндотелиальные сосудистые стенты, например, с использованием наших EPC, имитируют естественную выстилку стенки кровеносного сосуда и могут предотвратить рестеноз и тромбоз стента после его установки. Наша технология быстрого нанесения позволит покрывать внутрисосудистые устройства эндотелиальными клетками-предшественниками, полученными из крови самого пациента, в течение нескольких минут непосредственно в операционной или рентгенохирургическом кабинете. Таким образом, исключается необходимость длительного культивирования ex vivo.

Время пребывания пациента на самом устройстве сокращается, что делает технологию применимой для внедрения в клиническую практику.