Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Привет, я Кара Тед, я Лео. Со мной. И я Саймон Маккуин Мейсон.

Перевариваемость растической биомассы является темой большого интереса в настоящее время. Это связано с тем, что в полисахаридах клеточных стенок растений, составляющих эту биомассу, содержится большое количество сахаров; если удастся извлечь эти сахара в доступной форме, их можно подвергнуть ферментации для получения самых разных продуктов, таких как топливо и химические вещества. К сожалению, эти материалы крайне трудно переварить, поэтому понимание факторов, контролирующих эту перевариваемость, является актуальной и срочной задачей.

Чтобы иметь возможность использовать растительный материал для производства возобновляемой группы, нам необходимо уметь измерять потенциал сахарификации этих растений. Поэтому здесь, в Йоркском университете, мы проводим скрининг больших популяций растительного материала для определения их потенциала сахарификации. Сахарификация представляет собой процесс расщепления сложных углеводов до их моносахаридных компонентов для получения ценных химических веществ с помощью различных промышленных процессов.

Для измерения потенциала осахаривания мы воспроизводим промышленные процессы на микромасштабном уровне, подвергая биомассу предварительной обработке и ферментативному гидролизу для определения количества высвобожденных сахаров. Это позволяет выявить перспективные генотипы. Высокопроизводительная система работает в формате 6-луночного планшета IG.

Мягкие условия гидролиза используются для выявления незначительных различий между генотипами; кроме того, данный подход достаточно гибок, чтобы поддерживать различные виды субстратов, а также позволять оценивать разные ферменты. Используемый нами метод предполагает подготовку растительного материала в виде порошка, который затем подвергается предварительной обработке разбавленным кислотным или щелочным раствором при 90 °C в течение 20 минут. Затем проводится ферментативное расщепление с использованием коммерческой смеси целлюлаз при 50 °C в течение восьми часов.

Наконец, для определения высвобождения восстанавливающих сахаров используется метод с МБТГ. Растительный материал собирают в виде сухих стеблей, которые разрезают на сегменты длиной четыре миллиметра. Их помещают в пробирки объемом два миллилитра вместе с тремя металлическими шариками диаметром пять миллиметров.

Пробирки индивидуально маркируются штрихкодами, которые сканируются для обеспечения прослеживаемости образцов. Образцы загружаются в роботы для измельчения и форматирования. Образцы автоматически измельчаются и перемешиваются для последующего распределения биомассы по 96-луночным планшетам.

Пробирки прокалывают, затем перемещают в роботизированном манипуляторе так, чтобы они находились в вибрирующей воронке для дозирования порошка. Вибрация воронки регулируется весами для достижения целевой массы биомассы на одну лунку. Биомасса дозируется в 10 колонок планшетов, при этом две колонки оставляют для стандартов.

Выполняя по четыре повторности для каждого образца, мы загружаем 20 образцов на один планшет. Гидролизат из этого планшета будет разделен на три части в ПЦР-планшеты, что приведет к получению трех оптических планшетов. Таким образом, мы получаем три определения восстанавливающих сахаров на каждую лунку с биомассой.

После оформления планшеты герметизируют силиконовым матом для предотвращения испарения. По мере готовности планшеты перемещают в робот для работы с жидкостями. В роботе для работы с жидкостями предобработка, ферментативный гидролиз и определение высвобожденных сахаров выполняются автоматически.

На двухметровом столе расположены контейнеры с необходимыми реагентами, а также место для хранения пластиковых изделий. Имеются инкубаторы для предварительной обработки и гидролиза, а также термоциклеры для определения содержания сахаров. Предварительная обработка проводится в планшете с глубокими лунками.

Путем добавления разбавленных кислотных или щелочных растворов к порошку биомассы. Пластины переносят на термоблок и инкубируют при 90 °C в течение 20 минут. По завершении инкубации остатки реагентов предварительной обработки удаляют, промывая пять раз 500 µL ацетатного буфера.

После промывки после предварительной обработки добавляют коктейль из ферментов. Это стандартная смесь. Она содержит целлюлазу и Novozym 188 в соотношении 4:1 при концентрации 7 FPU на лунку.

Планшеты инкубируют в течение восьми часов при 50 °C при перемешивании. 75 µL полученного гидролизата переносят в ПЦР-планшет. В колонки 11 и 12 ПЦР-планшетов добавляют стандарты глюкозы.

Затем во все лунки добавляют 25 µL 1 M гидроксида натрия. В завершение в ПЦР-планшет впипетируют 50 µL реагента MBTH. После завершения переноса гидролизата в третий ПЦР-планшет планшет с глубокими лунками помещают на хранение.

Затем ПЦР-планшеты перемещают в термоциклеры для инкубации при 60 °C в течение 15 минут. Заключительным этапом процесса является перенос реакционной смеси в оптические планшеты для развития окраски. После инкубации ПЦР-планшеты извлекают из термоциклера.

К перенесенной реакционной смеси добавляют 100 µL окисляющего реагента. Для облегчения развития окраски процесс работы с жидкостями повторяют четыре раза в течение 24 часов, при этом предварительная промывка и добавление фермента занимают примерно два часа. Ферментативный гидролиз длится восемь часов, а определение содержания сахара занимает еще два часа.

Пока первый планшет инкубируется в течение восьми часов, начинается обработка следующего планшета. При таком распределении ресурсов робота достигается производительность 80 образцов в день для определения количества высвобожденных восстанавливающих сахаров. Оптическая плотность планшетов измеряется при 620 нанометрах.

Полученные результаты анализируют для количественного определения высвобождаемых сахаров в наномолях на миллиграмм на час реакции. Спасибо за просмотр, и я надеюсь, что это вдохновит ваши исследования в области биотоплива.