Однодневный рабочий процесс Схема бактериальных патогенов обнаружения и антимикробной сопротивления из крови культур

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации и оценке чувствительности к антибиотикам изолятов из культур крови за более короткое время, чем при использовании традиционных методов. Это достигается путем предварительной идентификации изолята из культуры крови с помощью нового метода мультиплексной ПЦР для анализа 16 S рибосомальной ДНК MultiPro.

Затем изолят инкубируют с панелью антибиотиков в течение шести часов. Следующим шагом является определение роста или подавления роста изолята в присутствии антибиотика с помощью количественного анализа 16 s рибосомальной Д-Н-К-П-Ц-Р. В конечном итоге результаты показывают, что идентификация и определение чувствительности к антибиотикам изолята из гемокультуры могут быть получены быстрее благодаря данной комбинации культивирования и ПЦР.

Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как системы Phoenix или IIC, является отсутствие необходимости в предварительном культивировании, а также возможность получить результаты идентификации и определения чувствительности к антибиотикам в тот же день. Процедуру продемонстрируют Ванди Хансон и ГИД, аспиранты нашей лаборатории. Разведите 100 µL посева крови, положительного на микробный рост, в реакционной пробирке, содержащей 900 µL 0.9% раствора хлорида натрия. Затем центрифугируйте образец при 13 400 ×g в течение пяти минут для осаждения бактерий.

Риз, суспендируйте осадок в 100 µL стерильной деминерализованной воды. Храните образец при температуре 4 °C до дальнейшего использования. Когда все образцы будут готовы, приготовьте смеси для реакции ПЦР в реальном времени для амплификации специфической 16 s рибосомальной ДНК интересующих бактерий.

Используйте деминерализованную воду, чтобы довести объем до 20 µL на одну реакцию. Внесите по 20 µL ПЦР-смеси в каждую лунку ПЦР-пластины на 96 лунок. Затем добавьте по пять µL образца в каждую лунку и загерметизируйте ПЦР-пластину.

Затем проведите ПЦР на системе ПЦР в реальном времени A BI Prism 7, 900 HT. Для анализа результатов по завершении ПЦР сначала перейдите на вкладку настроек анализа (analysis settings) и установите значение анализа CT на 0,1. Затем в конфигурации базовой линии (baseline) укажите начальный цикл 6 и конечный цикл 15. Запишите значение CT для каждого образца.

Пороговое значение, при котором результат ПЦР считается положительным, обычно устанавливается на уровне CT 35. В данном примере представлен профиль идентификации культуры крови, инфицированной e coli, в двух реакционных смесях. Были использованы универсальные праймеры к 16 s рибосомальной ДНК, которые дали две кривые амплификации со значениями CT 25,2 и 25,95.

Третья кривая амплификации получена с помощью зонда, специфичного для Coli. Другие специфические зонды не дали детектируемых сигналов. После идентификации патогена можно приступить к тестированию на чувствительность к антибиотикам.

Начните с переноса пяти миллилитров бульона из положительной гемокультуры в пробирку с разделителем сыворотки. Центрифугируйте образец при 2000 ×g в течение 10 минут; после центрифугирования удалите супернатант из пробирки. Затем с помощью стерильного ватного тампона перенесите бактерии из гелевого слоя пробирки в 0,9% sodium chloride до получения раствора с мутностью, соответствующей стандарту 0,5 по МакФарленду.

Это соответствует примерно 1,5 × 10⁸ колониеобразующих единиц на миллилитр. Далее разведите суспендизию в бульоне Мюллера-Хинтона двойной концентрации до получения концентрации приблизительно 5 × 10⁵ колониеобразующих единиц на миллилитр.

Внесите в каждую лунку микротитрационного планшета по 50 µL суспензии, при этом в каждой лунке уже должно находиться по 50 µL соответствующих антибиотиков. Обязательно включите положительный контроль роста для каждого образца, используя лунки с водой вместо антибиотиков. По завершении накройте планшет крышкой.

Затем инкубируйте планшет при 37 °C в течение шести часов для обеспечения роста бактерий. Обязательно сохраните аликвоту бактериальной суспензии при 4 °C в качестве отрицательного контроля роста. После шестичасовой инкубации перенесите содержимое каждой лунки и образец отрицательного контроля в отдельные стерильные пробирки.

После центрифугирования в течение пяти минут при 16 000 ×g удалите 80 мкл супернатанта и ресуспендируйте осадок в 80 мкл стерильной деминерализованной воды. Перед использованием для ПЦР в реальном времени 16S рРНК разведите образцы в воде в соотношении 1:10.

Приготовьте ПЦР-смесь, используя IQ cyber green super mix и праймеры к 16s рРНК, и внесите аликвоты по 20 µL в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Затем добавьте по 5 µL каждого образца в лунки и запечатайте планшет.

Затем проведите ПЦР для анализа результатов. Сначала рассчитайте пороговое значение CT. В целом, пороговое значение CT равно значению CT положительного контроля роста плюс 0.5 умноженное на значение CT отрицательного контроля роста минус значение CT контроля роста.

Однако для пиперациллина с тазобактамом и цефтазидима при воздействии на грамотрицательные палочки, а также для амоксициллина, оксациллина и триметоприма с сульфаметоксазолом при воздействии на Staphylococcus aureus или для амоксициллина при воздействии на Enterococcus spp. коэффициент умножения 0,5 следует снизить до 0,25. Чувствительность или резистентность штаммов в каждом образце можно определить путем сравнения CT образца с пороговым значением ct.

Значение CT выше порогового указывает на чувствительность, в то время как значение CT ниже порогового указывает на резистентность. Ниже приведен пример графика амплификации при определении чувствительности к антибиотикам. Штамм E. coli, идентифицированный ранее, был протестирован на чувствительность к нескольким антибиотикам, каждый из которых представлен отдельной кривой.

Образцы с низким значением CT — это образцы, в которых произошел рост в присутствии антибиотика, что указывает на устойчивость к тестируемому антибиотику. Напротив, высокое значение CT соответствует образцу, в котором рост не наблюдался, что указывает на чувствительность к тестируемому антибиотику. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает девять часов.