Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении возможности прямой визуализации дефицита митохондриальных дыхательных ферментов в свежезамороженных срезах тканей. Для этого сначала подготавливают срезы соответствующего органа на криостате. Вторым этапом процедуры является проведение гистохимического анализа на определение активности цитохром-с-оксидазы (ЦО), после чего проводится гистохимический анализ на сукцинатдегидрогеназу (СДГ).

Наконец, срезы ткани подвергают дегидратации, заключают в среду и накрывают покровным стеклом. В конечном итоге результаты позволяют определить степень митохондриальной дисфункции по интенсивности синего окрашивания клеток. Здравствуйте. Сегодня мы обсудим метод двойного гистохимического окрашивания по Коксу и SCH.

Хотя данный метод может быть применен для изучения митохондриальных заболеваний, он также может дать представление о процессах старения и возрастных расстройствах. После извлечения головного мозга животного, забитого в соответствии с этическим разрешением, быстро заморозьте его на сухом льду. Замороженную ткань, обернутую в алюминиевую фольгу, можно хранить при температуре -80 °C до момента изготовления срезов.

Подготовьте ткань к криосекционированию, поместив мозг на столик криостата и окружив его компаундом для заливки. Быстро поместите столик в криостат и соберите срезы толщиной 14 микрон при температуре -21 °C. Разморозьте срезы на предметных стеклах с помощью нагревательного блока, после чего оставьте стекла высыхать при комнатной температуре в течение одного часа.

Поместите предметные стекла в камеру для окрашивания с влажными полосками бумаги. Поскольку время реакции в данном анализе имеет критическое значение, рекомендуется обрабатывать не более 10 стекол за один эксперимент в химическом вытяжном шкафу. Приготовьте инкубационную среду, содержащую dab и цитохром C в PBS, и перемешайте на вортексе.

Быстро добавьте 2 µg бычьих CDE в среду и тщательно перемешайте с помощью вортекса. Чтобы разрушить все зерна CDE, продолжая работу в вытяжном шкафу, нанесите от 150 до 200 µL инкубационной среды на каждый предметное стекло, используя наконечник пипетки для равномерного распределения по всем срезам. Инкубируйте стекла в течение 40 минут при 37 °C.

Через 40 минут удалите инкубационную среду с предметных стекол. Промойте стекла в PBS четыре раза по 10 минут. После промывки верните стекла в камеру для окрашивания с влажными бумажными полосками, работая в вытяжном шкафу.

Приготовьте раствор NBT в PBS, стараясь защитить PMS от света; быстро перемешайте раствор на вортексе. С помощью наконечника пипетки нанесите от 150 до 200 µL раствора NBT на каждое стекло, равномерно распределяя его по всем срезам. Инкубируйте стекла в течение 40 минут при 37 °C, после чего удалите излишки раствора со стекол. Промойте стекла в PBS четыре раза по 10 минут каждый раз.

Обезвоживайте стекла по две минуты каждое в последовательно следующих концентрациях этанола: 70%, 70%, 95%, 95% и 99,5%. В завершение выдержите стекла еще 10 минут в дополнительном растворе 99,5%. Поместите стекла в ксилол на 10 минут, затем закрепите препараты с помощью LAN и накройте покровными стеклами.

Оставьте предметные стекла до полного высыхания на ночь или как минимум на один-два часа в вентилируемом помещении. Срезы мозга мышей дикого типа и мышей с преждевременным старением MT.DNA Mutator последовательно маркировали для определения активности COX и SDH.

В гиппокампе мышей дикого типа наблюдается нормальная активность Cox, о чем свидетельствует темно-коричневое окрашивание. Дефицит Cox, проявляющийся в виде синего окрашивания, был выявлен в гиппокампе мышей с мутацией мтДНК в возрасте 12 и 46 недель. К 46 неделям жизни у мышей с мутацией мтДНК наблюдалось дальнейшее снижение активности Cox, что указывает на широкомасштабное обострение дисфункции дыхательной цепи.

Недостаточное время инкубации (10 и 25 минут) привело к снижению осаждения коричневого продукта реакции DAB. Сокращенное время инкубации способствовало образованию синего конечного продукта Foran во время инкубации на SDH, что ошибочно указывало на наличие клеток с дефицитом COX. Смещение предметных стекол во время инкубации на COX также привело к некорректному образованию и осаждению продукта реакции DAB.

Хотя активность Cox и SDH может быть маркирована по отдельности, как показано здесь, последовательная маркировка оказалась более эффективной для локализации клеток с митохондриальной дисфункцией. Пример контроля специфичности активности COX и SDH в ткани мозга мыши дикого типа демонстрирует отрицательный результат маркировки. Помните, что работа с химическими веществами при двойном маркировании Cox SCH по данному протоколу крайне опасна, поэтому при каждом проведении этого анализа необходимо соблюдать меры предосторожности: использовать соответствующую лабораторную одежду и маску, работать в вытяжном шкафу, а также правильно утилизировать инкубационную среду.