Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении нейронального потомства непосредственно и исключительно из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с помощью индукции малыми молекулами. Это достигается путем добавления ретиноевой кислоты к недифференцированным клеткам, поддерживаемым в определенных условиях. Затем процесс дифференцировки продолжается путем отсоединения клеток в суспензионную культуру, где они образуют плавающие клеточные кластеры, называемые нейробластами.

Если нейробластам дать возможность прикрепиться к планшету для культивирования тканей в среде для нейрональной дифференцировки, они приобретают характеристики зрелых нейронов. В конечном итоге для демонстрации влияния обработки ретиноевой кислотой на морфологию и экспрессию маркеров обработанных эмбриональных стволовых клеток человека можно использовать иммунофлуоресценцию и деконволюционную или конфокальную микроскопию. В других методах лишь небольшая часть клеток приобретает нейрональный фенотип, тогда как наш метод позволяет осуществлять хорошо контролируемую и эффективную индукцию плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека исключительно в сторону нейрональной линии путем простого добавления малых молекул.

При приготовлении рабочих растворов из стоковых следует обратить внимание на несколько важных моментов. Необходимо медленно размораживать матригель и ламинин человека, перенося их из температуры -80 °C в 4 °C в течение ночи; среды следует хранить при 4 °C и всегда прогревать до 37 °C перед использованием. Кроме того, при приготовлении среды для hESL некоторые добавки вводятся непосредственно перед применением.

К ним относятся BFGF, аскорбиновая кислота, активный инсулин человека в A и трансферрин. Затем, непосредственно перед нанесением на планшет, приготовьте рабочие растворы Matrigel или ламинина человека. Инкубируйте планшеты при 37 °C в 5% CO₂ после того, как будут подготовлены культуральные планшеты с предварительным нанесением желатина.

Желатин можно заменить рабочим раствором матригеля или ламинина. Покройте эти планшеты, инкубируя их в течение ночи при температуре four degrees Celsius. Дайте колониям человеческих ЭСК расти от пяти до семи дней, после чего приступайте к пассированию.

Отоберите колонии, в которых более 75% представляют собой недифференцированные эмбриональные стволовые клетки (ES cells) человека; такие колонии обычно слегка опалесцируют, имеют четкие края и состоят из плотно расположенных клеток. Признаком начала дифференцировки обычно являются белые колонии, содержащие преимущественно дифференцированные клетки, которые обычно выглядят прозрачными. Не выбирайте белые или прозрачные колонии.

Поднесите планшеты к источнику света и с помощью маркера обведите слегка опалесцирующие колонии на дне планшетов по их контуру. Используйте край стерильного наконечника дозатора P2, чтобы отделить слой окружающих фибробластов от колонии человеческих ЭСК. Затем удалите окружающие клетки-фибробласты, а также все дифференцированные части колонии.

Теперь аспирируйте старую среду, содержащую отделившиеся дифференцированные клетки. Затем в каждой лунке однократно промойте недифференцированные клетки средой для культивирования ЭСК человека без BFGF, а затем добавьте три миллилитра свежей среды для культивирования ЭСК человека, содержащей BFGF; BFGF добавляется в свежую среду непосредственно перед использованием. Теперь с помощью стерильного наконечника дозатора P2 разделите колонии на мелкие фрагменты и отделите их от поверхности планшета.

Перенесите отделенные фрагменты колоний вместе с их средой в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте еще по 1 миллилитру среды для промывки каждой лунки.

Теперь клетки готовы к дальнейшей дифференцировке с использованием малых молекул. Сначала подогрейте свежепокрытые планшеты до 37 °C. Аспирируйте раствор для покрытия из планшетов, добавьте в каждую лунку по 4 мл среды, содержащей фрагменты колоний, после чего осторожно перенесите планшеты в инкубатор, избегая встряхивания.

Не тревожьте планшеты, чтобы обеспечить прикрепление клеток. После трех дней инкубации приготовьте свежую среду, содержащую омиковую кислоту. Затем удалите большую часть старой среды, оставив лишь небольшое количество, достаточное для того, чтобы клетки оставались погруженными в жидкость.

Не допускайте высыхания клеток в лунках. Добавьте 4 мл свежей среды для культур человеческих ЭСК с bFGF и ретиноевой кислотой. Заменяйте среду каждые два дня и поддерживайте рост колоний человеческих ЭСК, обработанных ретиноевой кислотой.

Спустя семь или восемь дней в клетках произойдут морфологические изменения, и они превратятся в крупные дифференцированные клетки. Затем приступайте к созданию суспензионной клеточной культуры; для этого начните с отделения колоний ESL от клеток, которые спонтанно дифференцировались и мигрировали, образовав слой фибробластов. Используйте вышеописанный метод со стерильным наконечником пипетки, затем аспирируйте старую среду, содержащую плавающие отделенные клетки фибробластов.

Однократно промойте клетки средой для HESC и снова суспендируйте их в трех миллилитрах среды для HESC. Затем, используя стерильный наконечник дозатора P2, разделите колонии на мелкие фрагменты и отделите их от поверхности планшета.

Перенесите среду с отделившимися колониями в одну коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте лунки одним миллилитром среды и добавьте промывочный раствор к общему объему. Затем распределите по 4 мл объединенного суспензионного раствора клеток в каждую лунку планшета на 6 лунок с ультранизкой адгезией на четыре-пять дней, поместив планшет в инкубатор.

В течение этого времени образуются плавающие клеточные кластеры или нейробласты, что способствует дальнейшему переходу нейробласта к более зрелому нейрональному фенотипу. Перенесите среду с их содержимым в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем центрифугируйте клетки при 1 400 об/мин в течение пяти минут.

Отососите и взвесьте максимально возможный объем старой среды, затем добавьте равное количество свежей среды для NSC, содержащей VEGF, NT-3 и BDNF. Перемешайте клетки до получения суспензии с помощью пипетирования, затем распределите по 4 мл суспензии в каждую лунку 6-луночных планшетов для культивирования тканей. Перенесите планшеты в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C.

Нейробласты оставляют на ночь для прикрепления к культуральным планшетам для создания 3D-культуры в Matrigel или человеческом ламинате с использованием суспензии нейробластов. 3D-матрикс полимеризуется при 37 °C. Смену среды осуществляют через день.

В течение двух недель появятся обширные сети нейронов с нейритами и пигментированных клеток; ретиноевая кислота в достаточном количестве индуцирует переход эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, поддерживаемых в данной определенной системе культивирования, из состояния плюрипотентности исключительно в нейроэпидермальный фенотип. При воздействии ретиноевой кислоты на недифференцированные ЭСК человека все клетки в колонии претерпели морфологические изменения, превратившись в крупные дифференцированные клетки, которые перестали экспрессировать маркер плюрипотентности OCT4. Клетки также начали экспрессировать различные маркеры нейроэктодермы, такие как HNK-1α, P2 и TRKC.

Эти крупные дифференцированные клетки продолжали делиться, и колонии увеличивались в размере, спонтанно экспрессируя ранний нейрональный маркер beta three tubulin. Более зрелый нейрональный маркер map two начал появляться в тех областях колоний, где клетки скапливались. Одновременно с появлением нейроэктодермальных клеток специфический нейрональный транскрипционный фактор NER one, участвующий в дифференцировке дофаминергических нейронов и активации гена тирозингидроксилазы, перемещался в ядро.

После открепления человеческие ЭСК, обработанные ретиноевой кислотой, формировали нейробласты в суспензионной культуре после удаления основного FGF; после прикрепления нейробластов к планшету для культивирования тканей начали появляться обширные сети нейритсодержащих нейрональных и пигментированных клеток, характерных для ЦНС, причем эффективность этого процесса резко возросла, и такие клетки могли культивироваться более трех месяцев. Эти нейрональные клетки, полученные из человеческих ЭСК, экспрессировали бета-III-тубулин по сравнению со спонтанной мультилинейной дифференцировкой клеток без обработки ретиноевой кислотой и коэкспрессировали MAP2. После освоения данная методика при правильном выполнении может быть использована для единообразного получения нейрональных предшественников и нейрональных клеток из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека примерно за четыре недели.

Не забывайте, что работа с клетками человека может быть чрезвычайно опасной, поэтому перед выполнением данной процедуры следует всегда принимать необходимые меры предосторожности, такие как проверка клеточных линий на отсутствие патогенов и микоплазмы.