Упрощенный метод получения ишемической модели ран
2 мая 2012 г.
Мы разработали минимально инвазивной техники для создания кролик ишемической модели рана уха путем деления центральных артерий и нервов и черепные пучка сосудисто-нервный. Туннель подкожной то режет все подкожные ткани. Эта процедура вызывает минимальные нарушения кожи и может безопасно использоваться в диабетических животных.
Общая цель следующего эксперимента заключается в том, чтобы дать возможность создавать ишемические раны не только у здоровых кроликов, но и у животных со сниженной резистентностью, например, пожилых или диабетических кроликов. Все применяемые в настоящее время методы создания ишемических ран являются высокоинвазивными, и до настоящего времени ни один из этих методов не мог быть использован у животных с диабетом. В данной процедуре применяется малоинвазивная хирургическая операция, которая начинается с выполнения трех небольших разрезов кожи над тремя сосудистыми пучками.
Следующим шагом является изоляция и защита центральной вены и сосудисто-нервного пучка ушной раковины, чтобы кровоток в ушной раковине был снижен, но не прекращен полностью. Наконец, остальные сосуды, нервы и подкожные ткани пересекают или перевязывают через разрезы кожи. Ишемию ушной раковины подтверждают по отсутствию артериального пульса, внешнему виду уха, разнице температур и уровню насыщения подкожных тканей кислородом.
Эта малоинвазивная операция может показаться сложной в исполнении, но на самом деле она очень проста. Главным преимуществом данной методики является минимальное повреждение кожного покрова. С момента первой публикации этого метода в 2007 году мы получили множество вопросов.
С тех пор мы еще больше упростили эту процедуру. Чтобы ее было еще проще выполнять без использования микроскопа, начните с взвешивания выбранного кролика, затем анестезируйте животное, используя смесь кетамина и ксилазина. Контролируйте показатели жизнедеятельности кролика; на дорсальной стороне можно идентифицировать три сосудистых пучка, снабжающих ухо.
Это центральный пучок, который является самым крупным и имеет коллатерали, соединяющиеся с другими сосудами; дорсальный пучок, в котором артерия обычно очень мала или отсутствует, и краниальный пучок. На вентральной стороне дистальная часть кожи не получает кровоснабжения от проксимальных сосудов.
Напротив, сосудистые пучки на дорсальной поверхности ушной раковины имеют многочисленные проникающие ветви, проходящие сквозь хрящ для обеспечения кровоснабжения дистальной вентральной кожи. У некоторых кроликов на вентральной стороне также присутствует очень маленький подкожный сосуд, который снабжает кровью не более одной трети вентральной кожи. При открытом циркумферентном разрезе кожи кровотечение из вентрального разреза практически отсутствует.
Перед началом процедуры убедитесь, что кролик не реагирует на болевые стимулы, проверив пальцевой зажим и глазной рефлекс; защитите глаза животного, нанеся мазь «искусственная слеза». Во время операции поддерживайте тепло кролика с помощью грелки. Затем, используя Бетадин и спирт, обработайте оба уха и окружающие участки кожи; накройте кролика стерильной салфеткой так, чтобы оставались открытыми только оба уха.
Одно ухо подвергнут ишемии, в то время как другое будет служить контролем. Инструменты, используемые для операции: хирургический нож с лезвием № 15, два пинцета — один для кожи, другой для остальных мягких тканей. Три зажима типа «москит», одна или две пары изогнутых микроножниц, одна пара маленьких ножниц для разрезания швов и плотных тканей, иглодержатель и несколько пробойников из нержавеющей стали.
Начните операцию с идентификации трех сосудистых ножек по артериям и венам. Используя скальпель с лезвием № 15, аккуратно сделайте один вертикальный разрез кожи на центральной сосудистой ножке.
Изолируйте центральную вену от окружающих тканей и защитите ее. На этом этапе центральная вена обхватывается для последующего ретракции.
Аккуратно препарируйте центральный нерв. Обычно он располагается с медиальной стороны от вены. Перережьте нерв ножницами.
Аккуратно выделите центральную артерию. Обычно она располагается с краниальной стороны и глубже вены; перевяжите артерию и пересеките ее. Очистите ткани вокруг центральной вены над ушным хрящом.
Второй разрез кожи выполняется над ножкой семенника. Для сохранения пучка сосуды выделяют и обводят лигатурой для защиты.
Это особенно полезно, когда вена крупная, как у данного кролика. Создайте туннель между этим местом и первым разрезом. Рассеките подкожные ткани над хрящом.
Третий разрез кожи делается над краниальным пучком. Весь этот пучок перевязывают и отделяют. Кожа над третьим пучком рассекается.
Эта вена расположена очень близко к коже, поэтому не делайте слишком глубокий разрез. Затем весь сосудистый пучок выделяют, перевязывают и отделяют. С помощью ножа и ножниц сформируйте подкожный туннель.
Три разреза проходят через все подкожные ткани, мышцы, нервы и мелкие сосудистые ветви. С помощью дополнительных острых и тупых методов диссекции очистите основание, обнажив хрящ шириной примерно от 5 до 10 миллиметров. Кровотечение можно остановить с помощью прижимания марлевых салфеток.
Электрокоагуляция не требуется. Кожу внутри уха не разрезают, так как она не имеет обильного кровоснабжения. Важным аспектом данной процедуры является обеспечение адекватного препарирования подкожного туннеля при одновременной защите сосудов.
Эта процедура не должна быть сложной. После достижения гемостаза три разреза кожи зашивают с помощью шовного материала 4-0 или 5-0, после чего повторно проверяют правильность закрытия разрезов и отсутствие кровотечения. Для тестирования лекарственных средств при лечении ран на вентральной стороне каждого уха с помощью стального просекателя диаметром 6 мм создают четыре круговые полнослойные раны кожи.
Расстояние между ранами должно составлять не менее 20–30 мм. Кожу и надхрящницу внутри прокола удаляют, не повреждая при этом хрящ. После создания ран на обоих ушах их временно накрывают марлей и переносят кролика в процедурный кабинет для нанесения препарата.
После очистки ран от сгустков крови нанесите исследуемый препарат и препарат контроля. Раны закрывают окклюзионной повязкой для предотвращения высыхания. При сравнении двух препаратов каждый из них наносят как на проксимальную, так и на дистальную рану.
Это позволяет контролировать различие в скорости заживления ран в дистальной и проксимальной частях ушной раковины в послеоперационном периоде. Ишемизированная часть уха обычно становится холодной и синюшной с пониженной чувствительностью дистальнее разреза. В течение нескольких дней может наблюдаться легкий отек, который проходит самостоятельно и не требует лечения.
Пульсация центральной артерии отсутствует. Подвижность ушной раковины снижена, но не устранена полностью, так как некоторые мышцы всё ещё прикреплены к основанию уха. При правильном формировании туннеля между разрезами будет виден четкий прогиб.
Для купирования возможного послеоперационного болевого синдрома на кожу спины прикрепляют фентаниловый пластырь. Ежедневно измеряют температуру кожи каждого уха с помощью термометра. Кровоток в ушной раковине измеряют с помощью прибора для измерения транскутанного парциального давления кислорода или лазерного допплеровского флоуметра.
Через одну неделю швы на разрезах кожи могут быть удалены из 2007. Данная процедура была применена более чем у 70 кроликов, включая 23 кролика с сахарным диабетом и четырех пожилых особей.
Разница температур между неишемическим и ишемическим ухом составляла от 1 до 10 °C, при этом у большинства кроликов этот показатель находился в диапазоне от 2 до 6 °C. Разница температур была выше в первые дни после операции, постепенно снижалась после 15-го дня, но всё еще сохранялась по истечении одного месяца. Из каждого уха было взято по шесть образцов ткани, и с помощью ВЭЖХ было измерено содержание высокоэнергетических фосфатов, как TP, так и общая энергия.
Концентрации были выше в нормальных ушах, чем в ишемизированных. Время заживления ран всегда было больше для ишемизированного уха, чем для неишемизированного, как у животных без диабета, так и у животных с диабетом (в группе из 15 кроликов без диабета). Среднее время заживления составило 17,8 дней на неишемизированном ухе против 21,8 дней на ишемизированном ухе.
У животных с диабетом продолжительностью 10–12 месяцев среднее время заживления составило 18,3 дня на неишемизированном ухе по сравнению с 29,1 днями на ишемизированном ухе. У всех животных, включая кроликов с диабетом, разрезы кожи заживали нормально и без осложнений. При диабете продолжительностью 24 месяца вентральные раны имеют более выраженную тенденцию к инфицированию.
Эта особенность делает модель более близкой к диабетическим ранам человека. Гистологический образец демонстрирует заживление подкожного туннеля, в котором отсутствует мышечная ткань, замещенная фиброзными тканями. При этом кожа остается неповрежденной.
При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости гуманного обращения с животными. После освоения этой методики ее выполнение занимает менее одного часа. Мы применили данный метод более чем на 70 кроликах, включая 23 кролика с сахарным диабетом, без каких-либо осложнений, таких как кровотечение или инфекция.
Соблюдение данного протокола делает процедуру очень безопасной. Для ответа на дополнительные вопросы, такие как изучение сосудистых язв, пролежней и диабетической нейропатии, могут быть применены другие методы, включая дополнительную ишемию, повреждение нервов и бактериальную инокуляцию.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена малоинвазивная методика создания модели ишемической раны уха у кроликов, которая особенно подходит для животных с сахарным диабетом. Метод заключается в тщальном рассечении сосудистых пучков для снижения кровотока при минимальном повреждении кожи.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Заживление ран
Теоретические основы
- Современные методы создания ишемических ран являются высокоинвазивными.
- Существующие методы не подходят для животных с сахарным диабетом.
- Минимально инвазивные подходы позволяют снизить количество осложнений.
- Понимание анатомии сосудов имеет решающее значение для проведения данной процедуры.
Цель исследования
- Разработать методику создания ишемических ран у кроликов.
- Обеспечить возможность проведения исследований на моделях диабета.
- Упростить хирургический процесс для более широкого применения.
Используемые методы
- Над сосудистыми пучками делают три небольших надреза кожи.
- Центральную вену и артерию изолируют и перевязывают.
- Для минимизации повреждения тканей создается подкожный туннель.
- После операции проводится тестирование препарата на ране.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно создать условия ишемии в ушной раковине.
- В ходе процедуры достигается минимальное повреждение кожи.
- Эта модель эффективна для изучения заживления ран у кроликов с сахарным диабетом.
- Отзывы указывают на то, что процедура проще, чем воспринималась изначально.
Выводы
- Этот минимально инвазивный метод безопасен для моделей диабета.
- Он позволяет проводить контролируемые исследования ишемических ран.
- Дальнейшие упрощения могут повысить доступность метода для исследователей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод восполняет критический пробел в исследованиях диабетических ран, позволяя создавать модели ишемических ран у животных с пониженной физиологической резистентностью, например, у кроликов с сахарным диабетом. Он способствует механистическому снижению рисков при оценке терапевтических кандидатов за счет воспроизведения компонента васкулопатии, который нарушает заживление диабетических ран у человека. Дизайн с использованием парных ишемических и неишемических ран у одного животного повышает прогностическую достоверность и снижает вариабельность при доклиническом скрининге.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в условиях ишемии, имитирующих патофизиологию диабетических ран у человека.
- Практическая ценность: предоставляет биологически релевантную систему для валидации мишеней, участвующих в процессах заживления, зависящих от состояния сосудов.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля препаратов за счет выявления соединений, которые оказываются неэффективными в условиях ишемии, несмотря на эффективность в неишемических моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать стандартизированные, воспроизводимые ишемизированные раневые поверхности для согласованной оценки соединений в различных исследованиях.
- Практическая ценность: минимизирует повреждение тканей и сложность процедуры, что увеличивает пропускную способность и снижает вариабельность показателей между животными.
- Готовность к анализу: позволяет создавать по четыре ишемизированные и четыре неишемизированные раны на одном животном, что обеспечивает наличие внутреннего контроля и эффективность рабочих процессов скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Моделирует ишемическое микроокружение, характерное для диабетических ран человека, что повышает релевантность данных о доклинической эффективности.
- Принятие решений с учетом рисков: Выявляет различия в ответе на препараты между ишемическими и неишемическими ранами, что позволяет уточнить критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go).
- Система, релевантная заболеванию: Продемонстрированная эффективность на диабетических животных с продолжительностью заболевания от 2 недель до 2 лет подтверждает применимость метода для моделирования хронических заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в цикл разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, в частности, для ран, где нарушение кровоснабжения является ключевым фактором неудачного заживления.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез об ишемия-зависимых путях и позволяет уточнить функции мишеней в условиях низкой перфузии.
- Скрининг: обеспечивает количественные показатели заживления ран с высокой воспроизводимостью, что позволяет надежно ранжировать соединения.
- Аналитика: предоставляет измеримые конечные точки, такие как время заживления, разница температур и уровни высокоэнергетических фосфатов для объективного сравнения.
- Трансляционные исследования: связывает этап поиска с доклинической валидацией путем моделирования васкулопатии — ключевого клинического барьера при заживлении ран.
- Корпоративное использование: упрощенная и надежная процедура может быть внедрена в различных группах и центрах для единообразного создания ишемических моделей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую точность за счет включения основного патофизиологического фактора — ишемии, которая отсутствует в стандартных моделях ран.
- Операционная ценность: снижает количество хирургических осложнений, нагрузку при обучении и межиндивидуальную вариабельность благодаря минимально инвазивным стандартизированным этапам.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления неэффективных соединений, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за неучтенной ишемической резистентности.
- Влияние на портфель: позволяет принимать решения о продвижении разработок с учетом рисков, основываясь на результатах в ишемических и неишемических условиях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в микрососудистой диссекции и технике наложения швов для точного лигирования артериальных, венозных и нервных пучков.
- Необходимы стерильные хирургические инструменты, включая скальпель с лезвием №15, микроножницы, зажимы-москиты и шовный материал для закрытия кожи.
- Требуется стандартизированный послеоперационный мониторинг с помощью температурных датчиков, транскутанной оксиметрии или лазерной допплеровской флоуметрии для подтверждения ишемии.
- Адаптация метода для различных модельных систем может потребовать анатомических корректировок в зависимости от размера и особенностей сосудов уха.
- Практическое ограничение: ишемический эффект может постепенно ослабевать примерно через один месяц, что требует своевременной оценки конечных точек.
