Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке

Общая цель данной видеостатьи — описать метод воздействия на адгезивные клетки условий ламинарного потока и оценки их реакции на количественно определяемые напряжения сдвига жидкости. Для этого сначала собирается контур потока без камеры потока. Контур включает резервуар, демпфер пульсаций, жесткие трубки, гибкие трубки, четырехходовые краны и подключенные к ним люэр-адаптеры, а также воздушный фильтр.

Следующим шагом является заполнение контура подходящим буфером, например, клеточной средой, в стерильных условиях, после чего следует запустить насос для заполнения демпфера пульсаций и удаления воздуха из трубок. Затем в нижнюю пластину проточной камеры вставляется предметное стекло с закрепленными клетками. Заключительным этапом процедуры является полная сборка проточного контура с подключением проточной камеры в линию.

В итоге можно получить результаты, демонстрирующие выравнивание флуоресцентно меченых эндотелиальных клеток-предшественников под воздействием напряжения сдвига жидкости в прозрачной камере с помощью флуоресцентного микроскопа. Для изучения функционального поведения клеток часто необходимо имитировать физиологию in vivo, подвергая клетки воздействию напряжения сдвига жидкости. Мы разработали камеру с параллельными пластинами и контур непрерывного потока, которые позволяют изучать клетки в условиях потока и наблюдать за ними через прозрачную камеру.

Данный метод может служить ценным исследовательским инструментом в области медицины и инженерии. Наша проточная камера позволяет осуществлять прерывистую или в режиме реального времени визуализацию клеток в потоке с использованием прямого или перевернутого микроскопа. Кроме того, конструкция доктора Ача Ника позволяет исследователям получать изображения клеток как на прозрачных, так и на рентгеноконтрастных поверхностях с помощью стандартных объективов микроскопа.

Кроме того, данный метод может служить важным инструментом в фармакологических исследованиях для изучения воздействия лекарственных препаратов на клетки в условиях потока. Визуализация установки имеет решающее значение, так как некоторые этапы трудно освоить, основываясь только на чтении протокола. Я предоставлю пошаговые инструкции по сборке потоковой камеры и контура потока, которые обычно используются в лаборатории доктора Ок Накст, для сборки контура потока.

Начните с того, что присоедините отрезок жесткой трубки длиной 36 дюймов к одному концу демпфера пульсаций, а к другому концу — отрезок мягкой трубки длиной 18 дюймов. На конце 18-дюймового участка мягкой трубки установите переходник с разъемом «папа» размером одну восьмую дюйма.

Подсоедините штекерный разъем к адаптеру с гнездовым разъемом размером 1/8 дюйма. Прикрепите гнездовой разъем к новому отрезку мягкой трубки длиной 18 дюймов. Просверлите три отверстия в крышке стеклянного стакана объемом 250 мл.

Для установки трубок вставьте отрезок мягкой трубки длиной 1.5 inch в одно отверстие в качестве воздушного клапана. Вставьте свободные концы жесткой и мягкой трубок через два других отверстия в крышке в стеклянную бутыль объемом 250 milliliter, которая будет служить резервуаром.

Убедитесь, что жесткая трубка достигает дна резервуара. Поддержание стерильности на протяжении всей сборки контура имеет решающее значение для успеха данной процедуры. Поэтому все детали должны быть стерилизованы, и на протяжении всего процесса необходимо использовать стерильные перчатки.

Помимо собранных деталей, следующие компоненты должны быть стерилизованы. Один полный проточный накопитель, сегменты мягкого трубопровода размером три на два дюйма, один адаптер Люра (папа) и один адаптер Люра (мама) размером одну восьмую дюйма, четыре винта с плоской головкой размером одну вторую дюйма, шесть винтов с плоской головкой размером 5/16 дюйма (8 витков на дюйм), один пинцет, одно предметное стекло и два полотенца, стерилизованные паром.

Автоклавирование при 121 °C в течение 60 минут. Поместите камеру потока контура потока, четыре четырехходовых крана, один одноходовой кран и все стерилизованные детали на это стерильное поле. В стерильных перчатках соедините два четырехходовых крана.

Закройте открытые порты для образцов колпачками. Отсоедините папа- и мама-адаптеры, соединяющие два сегмента гибких трубок контура потока, и установите на их место подключенные трехходовые краны. Подсоедините гибкую трубку, введенную в резервуар, к шприцу объемом 30 миллилитров и извлеките поршень шприца.

Наполните флакон 125 миллилитрами среды EPC. Снова подсоедините мягкую трубку к крану. Установите стерильный шприцевой фильтр в вентиляционное отверстие.

Теперь перенесите контур потока в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide. Закрепите жесткую трубку в головке роторного насоса Master Flex, предназначенной для использования с данным типом трубок Cole-Parmer. Убедитесь, что трубка не перекрывает направляющие крепления роторного насоса.

Отметьте маркером трубки в местах их выхода из головки насоса с обеих сторон. Убедившись, что все трехходовые краны закрыты со стороны портов для образцов и открыты по контуру потока, запустите насос. Проверьте направление потока.

Система PERFUSE eight должна перемещать жидкость из стеклянного резервуара через жесткую трубку в демпфер пульсаций. Для сборки потоковой камеры, используя стерильные перчатки, подсоедините отрезок мягкой трубки длиной 2 дюйма к female-адаптеру Люэром размером 1/8 дюйма. Подсоедините другой отрезок мягкой трубки длиной 2 дюйма к male-адаптеру Люэром размером 1/8 дюйма.

Подсоедините двухдюймовую мягкую трубку с разъемом «мама» к впускному порту, а двухдюймовую мягкую трубку с разъемом «папа» — к выпускному порту. Установите четырехходовые краны на оба этих разъема. Подсоедините оставшийся отрезок двухдюймовой мягкой трубки к боковому порту ловушки для пузырьков и с помощью стерильного пинцета установите одноходовой кран.

Извлеките предметное стекло с нанесенными клетками из сосуда для культивирования и поместите его в углубление на нижней пластине проточной камеры. Убедитесь, что стекло установлено стороной с клетками вверх; с помощью шприца или пипетки налейте 10 milliliters теплой среды для EPC на стекло с клетками. Дождитесь, пока среда покроет стекло в проточной камере, стараясь не допустить попадания среды на уплотнительное кольцо нижней пластины.

Установите верхнюю пластину проточной камеры на нижнюю пластину, совместив отверстия для винтов. Держите пластины параллельно друг другу, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в камеру, и закрутите винты. С помощью автоматической аккумуляторной отвертки удалите воздух из ловушки для пузырьков на входе, открыв односторонний стопорный кран, присоединенный к порту ловушки для пузырьков со стороны входа.

Используя шприц объемом 10 мл, аккуратно промойте входную трубку средой EPC, после чего закройте этот трехходовой кран и установите на него заглушку. Затем удалите воздух из канала камеры, открыв четырехходовой кран выходного порта и осторожно промыв проточную камеру средой EPC. Снова используя шприц объемом 10 мл, закройте все соединения четырехходовых кранов и установите на них заглушки.

Перенесите проточную камеру вместе со собранным контуром подачи в увлажненный инкубатор. Остановите насос проточного контура и перекройте краны в направлении потока, чтобы предотвратить утечку.

Подключите проточную камеру к контуру подачи потока. После подключения проточной камеры к контуру откройте стоп-краны по направлению потока. Запустите насос и убедитесь, что поток PERFUSE eight направлен в правильную сторону. Отрегулируйте скорость потока до достижения желаемого напряжения сдвига.

В ходе эксперимента с потоком камеру для потока можно извлечь из контура для визуализации клеток с помощью световой или флуоресцентной микроскопии. Для этого отсоедините камеру для потока от контура в местах соединений «кран-кран». Чтобы собрать перфузионные образцы для анализа, используйте восемь проб.

Сначала остановите насос и закройте стоп-кран, расположенный ближе всего к гасителю пульсаций. Снимите с него защитный колпачок, положив его вверх дном, чтобы избежать загрязнения. Вставьте небольшой шприц в порт для отбора проб.

Закройте трехходовой кран со стороны камеры потока, оставив открытым порт для отбора проб и контур со стороны демпфера пульсаций. Отберите из контура необходимый объем образца, затем закройте кран со стороны порта для отбора проб перед извлечением шприца. Поместите полученный образец в промаркированную пробирку и заморозьте при температуре минус 80 °C.

Закройте пробоотборный порт и убедитесь, что все краны открыты перед началом подачи потока. С помощью этого метода эндотелиальные прогениторные клетки из крови человека могут быть высеяны на титановые предметные стекла в течение 15 минут и адгезированы при физиологических силах сдвига. Как показано на этом рисунке, под воздействием потока площадь EPCs увеличивается с примерно 210 квадратных микрон сразу после высева до примерно 657 квадратных микрон через три часа и до примерно 1 152 квадратных микрон после 48 часов воздействия напряжения сдвига жидкости 15 dines на квадратный сантиметр.

Данное изображение, полученное с помощью светового микроскопа, иллюстрирует случайную ориентацию эндотелиальных клеток-предшественников (EPC) человека. После шестичасового периода статического пребывания вслед за тремя часами потока при нагрузке 100 dines на квадратный сантиметр клетки распластались, но сохранили случайную ориентацию. После 48 часов воздействия напряжения сдвига жидкости при 100 dines на квадратный сантиметр EPC выровнялись и ориентировались по направлению потока.

В данном случае EPCs были помечены CTO, а ядра клеток окрашены herx после завершения потока. Для сравнения на этом изображении представлены свиные EPCs на титановых подложках, выровненные по направлению потока. После 48 часов потока и воздействия напряжения сдвига силой 15 dines на квадратный сантиметр границы клеток были окрашены с помощью anti pcam, а ядра — красителем нуклеиновых кислот cytoxin.

Этот метод также позволяет получать образцы из системы PERFUSE 8 в заранее определенные моменты времени для анализа и/или количественного определения секретируемых метаболитов клеток. Здесь приведен пример продукции нитритов в ходе 48-часового потокового эксперимента с EPC свиньи. При выполнении данной процедуры важно постоянно поддерживать стерильность.

Кроме того, важно предпринять необходимые меры для уменьшения количества пузырьков воздуха в потоковой камере перед началом непрерывного потока, так как они могут привести к отрыву клеток. Мы также рекомендуем проверить каждое соединение в потоковой камере и контуре перед перфузией, чтобы предотвратить утечку PERFUSE eight во время эксперимента. Данная камера сконструирована со встроенными уплотнительными кольцами, которые обеспечивают полное прилегание верхней и нижней пластин и создают герметичное соединение без необходимости использования вакуумных насосов.

Эта особенность также обеспечивает постоянную высоту камеры между экспериментами и устраняет необходимость в использовании резиновых прокладок или регулировке. В нашей проточной камере используются стандартные предметные стекла. Благодаря этому большое количество клеток остается доступным для дальнейших экспериментов.

Например, РНК и ДНК из клеток после потока могут быть проанализированы для оценки синтеза белков или экспрессии генов. Конструкция нашего контура позволяет собирать восемь перфузионных образцов для анализа и количественного определения клеточных метаболитов, таких как нитрит — основного окислительного метаболита оксида азота, который секретируется клетками под воздействием гидродинамического напряжения сдвига. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как собрать нашу проточную камеру и стерильный проточный контур для воздействия гидродинамического напряжения сдвига на адгезивные клетки.