Количественное сравнение СНГ-Регуляторного элемента (CRE) Деятельность в Трансгенные Дрозофилы

Общая цель данной процедуры заключается в количественном измерении генно-регуляторной активности цис-регуляторных элементов (CRE), активных во время метаморфоза развития Drosophila melanogaster. Начните с применения методов сайт-специфической интеграции для создания линий с CRE, трансгенно встроенными в качестве репортерных трансгенов. Используя стереомикроскоп, отберите трансгенные экземпляры на соответствующей стадии развития.

Извлеките образцы из внешней пробирки и зафиксируйте их на предметном стекле микроскопа. Проведите конфокальный микроскопический анализ целых образцов для регистрации уровня и паттерна экспрессии флуоресцентного репортерного белка. В завершение количественно определите уровень экспрессии флуоресцентного репортерного белка на полученных конфокальных изображениях с помощью программного обеспечения Image J.

Эти результаты позволяют определить уровень регуляторной активности генов, чтобы выявить вспомогательные регуляторные элементы и облегчить дальнейшие сравнительные исследования экспрессии генов модифицированных версий CRE. Данная процедура может помочь ответить на ключевые вопросы, представляющие интерес в области регуляции генов и механизмов кодирования этой регуляции. Анализ ДНК имеет важное значение для биологии развития и эволюционной биологии.

Данная процедура была разработана для изучения цис-регуляторных элементов, функционирующих во время метаморфоза Drosophila melanogaster. В принципе, этот метод может быть применен к цис-регуляторным элементам, работающим на других стадиях развития, у других видов плодовых мушек или даже у других модельных организмов. Для расширения трансгенных линий через день подготавливайте по два флакона, помещая в них несколько самцов и самок.

Перенесите мух из одного из флаконов в новый флакон. Повторяйте эту процедуру в течение недели. По истечении двух недель убедитесь, что трансгенные плодовые мушки находятся на разных стадиях развития — от личиночной до взрослой.

Начните стадирование образцов в конце третьей личиночной стадии, когда формируется ER. Обратите внимание, что образец неподвижен. ER имеет размягченную белую структуру, а сферические образования смещены; укажите этот момент времени.

В момент 0 часов после оплодотворения (HAPF). Отличили самцов от самок по наличию билатерально расположенных гонад в средней части тела, которые выглядят как полупрозрачные круги, используемые для определения стадии развития на основе длительности метаморфоза. В момент 0 HAPF перенесите образцы в новую пробирку с помощью увлажненной кисти.

Добавьте кусочек салфетки Kimwipe и увлажните его водой, чтобы предотвратить высыхание образцов. Затем инкубируйте флакон при 25 °C до достижения желаемой стадии HAPF. В качестве альтернативы можно провести стадирование образцов путем сортировки на основе идентификации наличия и расположения нескольких морфологических маркеров, подробно описанных в сопроводительном тексте.

С помощью лабораторной ленты прикрепите кусок упаковочного скотча к препаировальной доске липкой стороной вверх. Смочите кисть для рисования и увлажните фиксированные образцы. Перенесите образцы на салфетку Kim wipe.

Перенесите образцы на упаковочную ленту и закрепите их дорсальной поверхностью вверх. Дайте образцам высохнуть в течение 15 минут. Постепенно раскройте ER с помощью пинцета.

Начните с переднего или пермного конца и продвигайтесь к заднему концу. Затем перенесите pui в каплю вязкого масла на предметное стекло и проведите микроскопическую оценку образца для цельных препаратов. Используйте объектив Forex или 10x, чтобы сфокусироваться на образце.

С помощью программного обеспечения конфокального микроскопа настройте длину волны возбуждения для нужного флуоресцентного белка, чтобы предотвратить фотовыгорание. Начните с интенсивности лазера от 5% до 10%. Если сигнал окажется недостаточным, увеличьте интенсивность по мере необходимости для улучшения соотношения сигнал/шум. Для конфокальных изображений активируйте в настройках ПО усреднение значений пикселей по нескольким сканам, например, усреднение по методу Калмана, для количественного сравнения активности CRE в области поперечного сечения, где флуоресценция проявляется наиболее интенсивно.

Переключитесь на таблицу поиска предупреждений о насыщении и отрегулируйте усиление напряжения и смещение канала до значений, при которых насыщается лишь несколько пикселей. При необходимости отрегулируйте конфокальную апертуру. После определения оптимальных настроек выполните ZS-сканирование для получения серии изображений вдоль оси Z.

По завершении сканирования преобразуйте стек изображений в проекцию и сохраните полученный файл изображения в формате TIF. Для количественного сравнения активности CRE используйте одинаковые настройки конфокального микроскопа для всех повторных образцов и линий с репортерным трансгеном. Для проведения эксперимента запустите программу Image J и откройте TIFF-изображение, которое необходимо проанализировать.

Нажмите кнопку произвольного выделения и обведите область образца, в которой необходимо провести количественный анализ. Чтобы получить статистику значений пикселей, перейдите на вкладку «Analyze» и выберите «Measure». Запишите среднее значение пикселя из окна результатов.

Также соберите второе среднее значение пикселей из фоновой области, где CRE неактивен. Чтобы получить скорректированное среднее значение пикселей, продолжайте рассчитывать статистику значений пикселей для повторных образцов. Затем на основе скорректированных средних значений пикселей повторных образцов определите среднюю регуляторную активность для A CRE и рассчитайте стандартную ошибку среднего.

В данном эксперименте интенсивность фенотипа восстановления белого цвета глаз используется для получения гомозиготных трансгенных линий. Для сайт-специфической интеграции трансгена используется генетический фон мутанта по гену white с последовательностью сайта приземления A TTP. Трансгенные особи, гемизиготные и гомозиготные по интегрированному вектору, различают по интенсивности фенотипа восстановленного цвета глаз, которая зависит от количества копий интегрированного мини-гена white.

Затем создаются гомозиготные линии путем скрещивания самцов и самок мух с наиболее темным фенотипом цвета глаз. Морфологические маркеры используются для определения стадии метаморфоза дрозофил при переходе из личинки во взрослую плодовую мушку. Образец проходит через серию стереотипных морфологических изменений, которые позволяют определить пол и приблизительную стадию развития. Здесь.

Версия дикого типа CRE, называемая диморфным элементом, обеспечивает высокий уровень экспрессии репортера EGFP в абдоминальном сегменте ASIC у самок puy. Было обнаружено, что последовательность из 13 пар оснований внутри этого CRE является сайтом связывания фактора транскрипции DSX, а значимость этой последовательности in vivo подтверждается количественным определением регуляторной активности CRE при мутации этого сайта связывания. Количественный анализ показывает, что мутация этого сайта DSX снизила регуляторную активность до 28 ± 3% от экспрессии дикого типа в контексте использованного здесь сайта вставки трансгена.

Аналогичные сравнения позволяют оценить регуляторную активность аллелей CRE внутри одного вида или аутологичных CRE разных видов, например, по сравнению с уровнями EGFP в женском сегменте. Аутологичные CRE для видов D. stimulants и D. willi, полученные с использованием штамма Canin S D. Melin gastric, демонстрируют регуляторную активность, равную 75 ± 4% и 0 ± 0% соответственно. Для получения дополнительных ответов на вопросы о том, как гены факторов транскрипции взаимодействуют с регуляторными элементами CYS, могут быть использованы такие методы, как РНК-интерференция генов факторов транскрипции.

Об этом будет свидетельствовать увеличение или снижение экспрессии флуоресцентного репортерного белка, которая управляется цис-регуляторными элементами после их разработки. Данная процедура открыла исследователям в области регуляции генов возможность изучить функциональную значимость мотивов цис-регуляторных элементов и возникших мутаций для экспрессии генов.