Мониторинг киназы и фосфатазы деятельности путем клеточного цикла Логометрический FRET
27 января 2012 г.
FRET основе репортеры все чаще используются для контроля киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Здесь мы опишем метод, как использовать FRET основе журналистам для оценки клеточного цикла зависит от изменений в целевую фосфорилирования.
В этом видео активность киназы и фосфатазы отслеживается на протяжении клеточного цикла с использованием ферстеровского резонансного переноса энергии или FRET. В данном случае зонд активности Polo-подобной киназы 1 или PLK1 содержит циановый флуоресцентный белок CFP на одном конце и желтый флуоресцентный белок YFP на другом. Этот зонд трансфецируется в клетки U2 OS.
Затем для изучения статуса фосфорилирования мишеней LK в период перехода из фазы G2 в фазу M трансфецированные клетки U2 OS подвергают тайм-лапс флуоресцентной визуализации. Когда CFP и YFP находятся в непосредственной близости и CFP возбуждается, энергия передается на YFP, и можно зафиксировать эмиссию YFP. Однако при фосфорилировании зонда происходит конформационное изменение белка, которое раздвигает CFP и YFP.
Теперь, при возбуждении CFP, детектируется сильное излучение CFP и лишь слабое излучение YFP; количественное определение соотношения излучения YFP после возбуждения как CFP, так и YFP демонстрирует, что активность PLK1 возрастает в фазе G2 и достигает пика во время митоза. Таким образом, основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как стандартная геометрическая съемка, является особое внимание к тому, чтобы клеточный цикл не нарушался ни условиями съемки, ни экспрессией зонда. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения клеточного цикла, например, где и когда активируются специфические киназы или фосфатазы.
Хотя этот метод позволяет получить представление о ферментах, регулируемых клеточным циклом, его также можно применять в других системах, где требуются условия отсутствия сыворотки, например, в анализах пролиферации клеток. Для мониторинга клеточного цикла клеток человека клетки U2 OS трансфицируют FRET-зондом активности PK1. С использованием стандартного метода трансфекции фосфатом кальция клетки селектируют пуромицином в течение не менее семи дней.
Это обогащает популяцию клеток, экспрессирующих зонд, и ограничивает количество клеток с токсическими уровнями экспрессии или такими уровнями экспрессии, которые серьезно влияют на клеточный цикл. Затем стабильные клоны отбирают методом ограниченного разведения по экспрессии CFP, после чего исследуют экспрессию YFP, чтобы убедиться, что они присутствуют во всех клетках примерно в одинаковом соотношении. Если некоторые клетки содержат только CFP или YFP, вероятно, произошла рекомбинация; в этом случае повторите подготовку плазмиды, используя бактерии, менее склонные к гомологичной рекомбинации, такие как клетки sure 2, затем линеаризуйте плазмиду и повторите трансфекцию.
После того как клетки начнут стабильно экспрессировать зонд, высейте их в чашки стеклянным дном толщиной 1,5, когда они прикрепятся и достигнут 30–50% конфлюэнтности. Замените среду на CO2-независимую, не содержащую феноловый красный. Поместите клетки под моторизованный эпифлуоресцентный микроскоп с контролем температуры, установленной на 37 °C. Микроскоп должен быть оснащен фильтрами возбуждения и эмиссии для CFP и YFP.
Зеркало ROIC, подходящее для мониторинга CFP и YFP, а также объектив, обеспечивающий необходимое разрешение. В данном случае используется воздушный объектив 20 x NA 0,75. Используя проходящий свет, настройте фокус на клетках.
На данном этапе не используйте флуоресцентный свет, так как он может вызвать стрессовый ответ, который нарушит клеточный цикл. Чтобы избежать фототоксичности, установите максимально возможный изгиб, обеспечивающий необходимое субклеточное разрешение. Для данного эксперимента должно быть возможно различие между ядром и цитоплазмой.
Установите короткое время экспозиции и вставьте фильтр с высокой нейтральной плотностью. Затем получите тестовое изображение с разрядностью 12 или 16 бит. Используя возбуждение и эмиссию YFP, отрегулируйте время экспозиции и нейтральные фильтры таким образом, чтобы средняя интенсивность в клетке была примерно равна интенсивности фона плюс пятикратная разница между минимальной и максимальной интенсивностью фона. Чтобы убедиться в отсутствии насыщения изображений, проверьте интенсивность флуоресценции на тестовом изображении.
Максимальная интенсивность на изображении должна составлять менее половины динамического диапазона, чтобы обеспечить возможность регистрации различий в интенсивности при вступлении клеток в митоз. Затем повторите этот процесс, используя фильтры возбуждения CFP и эмиссии YFP. Выберите несколько областей с трансфицированными клетками, исключая области, которые использовались для фокусировки и оптимизации условий экспозиции.
Поскольку эти процедуры могли вызвать стрессовый ответ, убедитесь, что максимальная интенсивность составляет менее половины динамического диапазона для всех клеток. Настройте программное обеспечение для получения двух изображений каждые 45 минут, используя возбуждение YFP, эмиссию YFP и возбуждение CFP. Фильтры эмиссии YFP.
Также установите общую продолжительность эксперимента так, чтобы она превышала длительность клеточного цикла. После завершения всех настроек начните получение изображений. По окончании сбора данных откройте полученные изображения и отследите время клеточного цикла от одного митоза до другого. Для клеток, экспрессирующих трансфецированный зонд в данном случае, время клеточного цикла составило примерно от 20 до 25 часов.
Сравните полученные результаты с контрольными данными для используемого типа клеток. Если время клеточного цикла соответствует эталонным значениям, можно приступить к анализу FRET. После подтверждения временных параметров можно проводить анализ изображений.
Анализ можно выполнить в большинстве программ, предназначенных для микроскопии. В данном случае используется бесплатное программное обеспечение Image J с плагином Ratio Plus. Начните анализ, открыв изображения в Image J. Если изображения представлены в формате многоцветного стека, разделите отдельные каналы, преобразовав их в гиперстек через меню выбора изображения.
Затем выберите «Hyperstack», а затем «Stack to Hyperstack». Откроется окно преобразования в гиперстек с отображаемыми настройками, нажмите «OK». Теперь изображение будет отображаться с двумя ползунками под ним.
Для разделения изображений на одноканальные стеки нажмите на изображение и выберите «Hyperstack Reduce Dimensionality». В открывшемся окне убедитесь, что выбраны параметры «frames» и «keep source», после чего нажмите «Okay».
Появится новое изображение, содержащее только один канал. Повторите этот процесс, чтобы вывести новое изображение со вторым каналом. Затем, для повышения визуальной четкости итоговых изображений, выберите стек YFP excitation YFP emission.
Нажмите на «Process», затем выберите «Math». В открывшемся окне умножения введите цифру три, чтобы умножить стек возбуждения YFP и эмиссии YFP на три. Этот шаг является необязательным и позволяет избежать получения коэффициентов в диапазоне от нуля до одного.
Затем на панели инструментов ImageJ выберите инструмент «Freehand selection» (Произвольная область). После этого в стеке возбуждения YFP и эмиссии YFP обведите область интереса (ROI) на участке, где нет клеток, но который находится рядом с клеткой, подлежащей измерению. Чтобы добавить ROI в менеджер областей, перейдите в меню «Analyze» (Анализ), затем выберите «ROI Manager».
Появится окно менеджера ROI. Нажмите «add», чтобы сохранить координаты ROI для измерения средней интенсивности ROI в стеке возбуждения YFP и эмиссии YFP. Нажмите «analyze», затем выберите «measure».
Откроется окно результатов. Выберите стек с возбуждением CFP и эмиссией YFP. Затем дважды щелкните по ROI в менеджере ROI и повторите измерение.
Измерение добавляется в окно результатов. Прокрутите стек до других областей, чтобы повторить этот процесс для нескольких временных точек. Убедитесь, что интенсивность фона вблизи исследуемой клетки остается примерно одинаковой на протяжении всего фильма, сравнивая измерения в окне результатов.
Чтобы настроить измерения с учетом минимальной интенсивности, нажмите «Analyze», затем нажмите «Set Measurements» и укажите минимальное и максимальное значения серого цвета. После этого откроется окно с альтернативными вариантами измерений. После необходимости регулировки яркости и контрастности выделите ROI, охватывающий большую часть клетки, и измерьте минимальную интенсивность в обоих стеках.
Затем проведите измерения так же, как и ранее, но на этот раз используя клетку вместо фона. Используя значения из разделов результатов, вычислите разницу между измеренной минимальной интенсивностью и интенсивностью фона и разделите ее на два. Это позволит получить предварительную оценку значения отсечения (clipping value) для настройки соотношения открытия в соответствующих плагинах.
Затем перейдите в раздел Ratio Plus. Для определения соотношения FRET выберите стек S1 с возбуждением CFP и эмиссией YFP или, для визуализации зондов с обратным соотношением FRET, при которых эффективность FRET снижается при фосфорилировании, выберите стек S1 с возбуждением YFP и эмиссией YFP. Введите измеренные значения интенсивности фона и значения отсечки (clipping values).
Возьмите значения из окна результатов и вставьте их в окно ratio plus. Настройте масштабирование полученного стека соотношений и примените подходящую таблицу поиска (LUT) для визуализации изменений соотношения. Клетки U2 OS, экспрессирующие FRET-зонд для мониторинга активности PLK1, снимали в течение 60 часов, как описано в данном видео.
На данном изображении показан совокупный вход в митоз 50 клеток, экспрессирующих FRET-зонд, включая деления дочерних клеток. Большинство клеток, экспрессирующих зонд, пролиферируют с длительностью клеточного цикла от 20 до 25 часов, что указывает на то, что условия визуализации и уровни экспрессии зонда не влияют на время клеточного цикла. Псевдоцветовое представление инвертированного соотношения FRET при отслеживании одной клетки на протяжении четырех делений демонстрирует, что, несмотря на значительный шум, наблюдается тенденция к увеличению активности PK1 в фазе G2 с достижением пика во время митоза.
Когда необработанные данные подвергаются усредняющему фильтрованию и представлены в виде графика, время между пиками активности становится легко оцениваемым. На данном рисунке приведена количественная оценка инвертированного отношения FRET для клетки, показанной на предыдущих изображениях, на основании графика. Можно оценить время активации; как видно здесь, фосфорилирование зонда становится заметным примерно за четыре часа до достижения пика фосфорилирования в митозе.
При выполнении данной процедуры важно поддерживать клетки в состоянии отсутствия стресса, что достигается путем минимизации воздействия света, а также сведения к минимуму изменений температуры или pH. Также важно помнить, что данный метод позволяет контролировать баланс между активностью киназ и фосфатаз в клетке. Эту процедуру можно сочетать с РНК-интерференцией или скринингом ингибиторов для идентификации вышестоящих регуляторов данных киназ и фосфатаз.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод мониторинга активности киназ и фосфатаз в живых клетках с использованием репортеров на основе FRET. Основное внимание уделяется оценке зависимых от клеточного цикла изменений в фосфорилировании мишеней.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биохимия
Теоретические сведения
- FRET (фёрстеровский резонансный перенос энергии) — это эффективный метод изучения белковых взаимодействий.
- Киназы и фосфатазы играют ключевую роль в клеточной сигнализации и регуляции.
- Мониторинг этой активности в живых клетках позволяет получить представление о клеточных процессах.
- Клеточный цикл является критическим периодом для изучения изменений фосфорилирования.
Цель исследования
- Продемонстрировать использование репортеров на основе FRET для мониторинга активности киназ.
- Оценить изменения фосфорилирования в течение клеточного цикла.
- Представить визуальный метод отслеживания этих биохимических процессов в режиме реального времени.
Используемые методы
- Трансфекция клеток U2 OS FRET-зондом, содержащим CFP и YFP.
- Флуоресцентная прижизненная визуализация (time-lapse) для наблюдения за статусом фосфорилирования.
- Возбуждение CFP для детектирования переноса энергии на YFP.
- Анализ конформационных изменений зонда при фосфорилировании.
Основные результаты
- Успешный мониторинг активности киназы на протяжении всего клеточного цикла.
- Продемонстрированные изменения эффективности FRET, коррелирующие со статусом фосфорилирования.
- Получены визуальные доказательства активности киназы во время перехода из фазы G2 в фазу M.
- Подчеркнута полезность FRET в исследованиях с применением визуализации живых клеток.
Выводы
- Репортеры на основе FRET эффективны для мониторинга активности киназ и фосфатаз.
- Этот метод позволяет в режиме реального времени наблюдать изменения фосфорилирования, зависящие от клеточного цикла.
- Данный подход может быть применен в различных исследованиях в области клеточной биологии и биохимии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Мониторинг активности киназ и фосфатаз на протяжении всего клеточного цикла позволяет точно исследовать динамику передачи сигналов, что имеет решающее значение для валидации мишеней в онкологии и изучения путей пролиферации клеток. Данный ратиометрический метод FRET обеспечивает количественные показатели баланса фосфорилирования в режиме реального времени, что способствует снижению механистических рисков за счет установления связи между активностью ферментов и прогрессией клеточного цикла без нарушения естественной физиологии. Этот метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска путем определения времени и места активации специфических киназ, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) в рамках процессов идентификации соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет напрямую наблюдать за балансом активности эндогенных киназ и фосфатаз в живых клетках, что проясняет терапевтические гипотезы и участие сигнальных путей.
- Практическая ценность: используются стандартное оборудование для микроскопии и методы трансфекции, что не требует специальных навыков для внедрения в исследовательских лабораториях.
- Прогностическая ценность: отслеживает изменения активности в ходе перехода G2/M, обеспечивая временное разрешение для установления связи между активацией киназ и фенотипическими результатами в анализах пролиферации.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: генерирует рациометрические показатели FRET, устойчивые к вариабельности уровней экспрессии и артефактам визуализации, что обеспечивает надежный скрининг соединений.
- Количественный выход: измеряет отношения эмиссии YFP/CFP для количественной оценки статуса фосфорилирования, что позволяет проводить анализ доза-эффект и профилирование ингибиторов.
- Масштабируемость: при соответствующей адаптации совместим с таймлапс-визуализацией в многолуночных форматах, что позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг активности киназ в популяциях, подвергнутых воздействию лекарственных препаратов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: Позволяет контролировать активность PLK1 — митотической киназы, которая часто подвергается дисрегуляции при раке, что связывает молекулярный механизм с фенотипами клеточного цикла.
- Трансляционная преемственность: Связывает ранние наблюдения по взаимодействию с мишенью с функциональным прохождением клеточного цикла, что способствует доклинической валидации с использованием биомаркеров.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет отличить киназозависимое фосфорилирование от противодействия фосфатаз, что снижает количество ложноположительных результатов в исследованиях модуляции мишеней.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, при этом показатели динамической активности позволяют оценить влияние соединений на узлы сигнализации до этапа фенотипического подтверждения.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез путем визуализации пространственно-временных паттернов активации киназ в живых клетках, что позволяет прояснить модуляцию сигнальных путей.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет рациометрической нормализации, что повышает воспроизводимость результатов в различных условиях и временных точках.
- Аналитика: Позволяет получать количественные показатели соотношения для сравнения состояний активности киназ, что способствует обсуждению зависимости «структура — активность».
- Трансляционные исследования: Сопоставляет модуляцию молекулярной мишени с фенотипами выхода из клеточного цикла или остановки цикла, поддерживая критерии принятия решения (go/no-go) в доклинических моделях.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для мониторинга любой пары киназа/фосфатаза благодаря модульному дизайну зондов, что снижает затраты на повторную разработку в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов баланса киназы и фосфатазы, уменьшая неопределенность при валидации мишеней и анализе путей передачи сигнала.
- Операционная ценность: использует широко доступное оборудование (эпифлуоресцентный микроскоп, стандартные фильтры) и программное обеспечение (ImageJ с плагином Ratio Plus), что снижает барьер для внедрения метода.
- Стратегическая ценность: повышает уверенность при принятии решений, связывая биохимическую активность с прогрессией клеточного цикла, что снижает вероятность неудач на поздних этапах из-за непредвиденных эффектов сигналинга.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе профилей активности, зависящих от клеточного цикла, что повышает эффективность использования капитала при оптимизации ведущих соединений.
Особенности реализации
- Требуются навыки молекулярного клонирования для создания FRET-зондов с доменами CFP/YFP и фосфосенсорными доменами.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии с возбуждающими и эмиссионными фильтрами для CFP/YFP, системой контроля температуры и установкой для визуализации с низкой фототоксичностью.
- Требуются стандартизированные рабочие процессы трансфекции и клонального отбора для обеспечения равномерной экспрессии зондов без нарушения клеточного цикла.
- Требуется тщательная оптимизация времени экспозиции и использование нейтральных светофильтров во избежание насыщения и фототоксичности при длительной визуализации.
- Необходимы навыки анализа изображений для обработки рациометрических данных с помощью таких инструментов, как ImageJ и плагин ratio plus, для точного количественного анализа.
