Мониторинг Расколотая активность каспазы-3 и Апоптоз Иммортализованные Олигодендроглиальные Клетки с использованием живых клеток и цифровой обработки изображений Cleaveable флуорогенных краски Подложки После калий-индуцированной деполяризацию мембраны

Данная процедура позволяет в режиме реального времени наблюдать за гибелью глиальных клеток при повреждении ДНК олигонуклеотидов. Для этого сначала культивируют клетки, затем подготавливают их к прижизненной визуализации. Следующим этапом является воздействие на клетки и мониторинг эффектов с помощью флуоресцентной микроскопии.

Заключительным этапом является анализ данных. В конечном итоге результаты демонстрируют скорость гибели клеток в популяции после воздействия или стимуляции путем мониторинга ядерной флуоресценции с использованием флуоресцентного красителя, активируемого каспазами. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как иммуноокрашивание, является возможность одновременного сбора данных в нескольких временных точках.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, такие как реакции на фармакологическое воздействие, воздействие реагентов и различные виды терапии. В настоящее время этот метод позволяет получить представление о процессах гибели клеток в клеточных культурах. Он также может быть применен к другим системам, таким как ткани ex vivo и органотипические ткани, включая срезы головного мозга.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями в процессе адаптации к работе с живой тканью вместо фиксированной. Визуальная демонстрация этой техники имеет важное значение, так как подготовка образцов живых клеток включает значительно больше этапов, чем работа с фиксированной тканью. Сначала разморозьте замороженные иммортализованные глиальные клетки N 19 oligo droog на водяной бане при 37 °C.

Добавьте семь миллилитров среды DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, в культуральную чашку диаметром 10 сантиметров. Затем по каплям добавьте суспензию клеток в чашку и осторожно встряхните чашку Петри для равномерного распределения клеток. Культивируйте клетки при 34 °C в инкубаторе с 5% CO2 в течение четырех часов.

Отоспертируйте среду из планшетов, чтобы удалить остатки DMSO.Криопротектора. Замените ее семью миллилитрами свежей среды после четырех-семи дней роста. Когда клетки достигнут 70–80% конфлюэнтности, отоспертируйте среду и пипеткой нанесите один миллилитр капель на клеточный пласт, инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем соберите клетки и засейте ими чашку для культивирования тканей диаметром 10 см с плотностью 0.1 × 10⁶ клеток/мл, после чего поместите чашку в инкубатор для культивирования тканей. После еще одного пассажа клетки можно высеять для проведения экспериментов по визуализации живых клеток. Для этого соберите клетки аналогичным образом, затем возьмите 30 µL клеточной суспензии и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.

Затем с помощью стерильного пинцета поместите непокрытые стеклянные покровные стекла. В лунки шестилуночного планшета внесите клетки с плотностью 0,1 × 10⁶ клеток/мл. В 2 мл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы без фенола, дополненной 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, прокультивируйте клетки в течение ночи при 34 °C и 5% CO₂ перед трансфекцией.

На следующий день смешайте 100 µL безсывороточной среды, от 0,5 до 4 µg очищенной плазмидной ДНК и 4 µL FUgene HD. Осторожно перемешайте смесь на вортексе дважды, затем оставьте ДНК для образования комплексов при комнатной температуре на пять минут. По истечении времени инкубации добавьте смесь ДНК с FUgene HD непосредственно к культивируемым клеткам.

Осторожно наклоните планшет для перемешивания. Затем культивируйте клетки еще 48 часов при 34 °C и 5% carbon dioxide перед началом обработки или проведения эксперимента. Сначала включите блок управления прибором для визуализации живых клеток LCI Cham light.

Это следует сделать за три часа до начала эксперимента, чтобы обеспечить тщательный прогрев предметного столика. Как минимум, блок управления должен быть включен за один час до начала эксперимента. Затем, работая в ламинарном шкафу, обработайте камеру для культивирования LCI Cham светового магнитного типа и пинцет 70% ethanol и дайте им высохнуть в течение пяти минут.

Извлеките клетки из инкубатора и осмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться в их жизнеспособности. Клетки должны выглядеть здоровыми, быть хорошо распластанными по покровному стеклу и иметь многочисленные мембранные отростки. Клетки с сокращенным количеством отростков или ядром неправильной формы, скорее всего, подверглись стрессу в результате трансфекции и не подходят для дальнейших экспериментов в ламинарном шкафу.

Наклоните шестилуночный планшет и извлеките покровное стекло с помощью пинцета. Быстро поместите покровное стекло стороной с клетками вверх в нижнюю часть камеры. Не допускайте высыхания покровного стекла.

Затем присоедините магнитный основной корпус культуральной камеры и добавьте 500 µL среды из исходного шестилуночного планшета на верхнюю поверхность покровного стекла. Повторное использование среды снижает уровень стресса клеток, вызванного изменениями окружающей среды, а также может быть полезным для оценки секретируемых внеклеточных факторов. После добавления среды установите стеклянную крышку на культуральную камеру и с помощью салфетки Kim wipes, смоченной 70% этанолом, удалите с нижней стороны покровного стекла любые остатки материала, которые могли бы помешать проведению микроскопии.

Поместите культуральную камеру в инкубатор при 34 °C и 5% carbon dioxide на 30 минут. Этот этап необходим для того, чтобы сама камера нагрелась до 34 °C, что позволит уменьшить смещение покровного стекла. Пока металл нагревается, на следующих этапах необходимо работать при максимально возможном приглушенном комнатном освещении.

Сначала Тора предварительно подготовила раствор для визуализации ядер при комнатной температуре. Затем извлеките культуральную камеру из инкубатора и быстро поместите ее в климатическую камеру микроскопа. Откройте баллон с 5% предварительно смешанным углекислым газом с двойным регулятором.

Затем, используя объектив с 10-кратным увеличением при напряжении лампы микроскопа около 2,5 вольт и времени экспозиции 240 миллисекунд, сфокусируйтесь, используя микроскопию в светлом поле, чтобы визуализировать клетки на мониторе компьютера. После этого добавьте к клеткам ионы калия в концентрации 80 миллимоляр или другой индуктор апоптоза путем замены среды с использованием медленной локальной перфузии с помощью перистальтического насоса.

Субстрат nuke view 4 88 стабилен в клеточной культуре для экспериментов продолжительностью до 36 часов. Следовательно, проведение экспериментов в течение этого времени возможно. Сначала настройте микроскоп для визуализации флуоресценции красного и зеленого флуоресцентных белков.

Затем нажмите на красный канал, чтобы отобразить трансфецированные клетки. Выберите и сохраните примерно 12 кадров, на которых присутствует несколько трансфецированных клеток, и запомните эти координаты XY-столика. Настройте микроскоп на захват изображений в светлом поле, красном и зеленом каналах в этих сохраненных точках столика каждые шесть минут.

После сбора нескольких XY-точек в дубликатах или трипликатах экспериментов объедините данные из отдельных опытов, проведенных в разные дни, и выполните анализ данных и статистическую проверку, как описано в письменном протоколе, чтобы сравнить соотношение отрицательных и положительных клеток по маркеру CASP bay. Субстрат Nuke view 4 88 может указывать на повышенную скорость апоптоза в культурах глиальных клеток N 19 oligo DDR. Данные исходные изображения были получены с использованием объектива 10х после воздействия высокой концентрации внеклеточного калия.

Клетки N 19 были трансфецированы RFP, после чего их либо обрабатывали 3 µL субстрата NukeVue 488 (для контрольных клеток), либо 3 µL субстрата NukeVue 488 и 80 мM калия. Эти изображения показывают, что количество апоптотических клеток увеличивается с течением времени (через 3, 6 и 9 часов) после обработки 80 мM калия; в контрольных условиях значительного уровня апоптоза по сравнению с культурами, обработанными 80 мM калия, не наблюдалось. Фоновый зеленый сигнал, наблюдаемый в контрольных условиях, указывает на клетки, подвергающиеся апоптозу без добавления внеклеточного калия.

12-часового временного интервала достаточно для исследований, связанных с неврологическими повреждениями. Через 12 часов в культурах, подвергнутых воздействию калия, наблюдалась гибель примерно 45% клеток. Практически ни одна из клеток в контрольном эксперименте не проявляла признаков апоптоза к 12-часовой временной точке. Тем не менее, в других ситуациях может потребоваться более длительное проведение экспериментов.

На этом графике показано увеличение числа каспаза-3-положительных клеток в течение 12-часового эксперимента. При оптимизации этот метод можно выполнить за один час, а сбор данных — за ночь, если все сделать правильно. При выполнении данной процедуры важно соблюдать единообразие в обработке всех образцов в соответствии с описанным протоколом.

Для изучения других нижележащих белков, участвующих в исследуемых путях, можно использовать иные методы, такие как иммуноокрашивание. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать образцы для визуализации. Соберите набор данных и проведите их анализ.